Die Autoren danken dem gesamten ACEnano-Konsortium für die fruchtbaren Diskussionen in allen Phasen der Vorbereitung des hier vorgestellten Protokolls. Die Autoren schätzen auch die Finanzierung aus dem Programm Horizont 2020 der Europäischen Union (H2020) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 720952 im Rahmen des ACEnano-Projekts.

1. AF4-Systemaufbau
<ol><li>Montieren Sie die AF4-Patrone und schließen Sie alle Hardwarekomponenten des AF4-Systems und des UV-Vis-Detektors(Materialtabelle) gemäß den Anweisungen im Herstellerhandbuch an.</li>
	<li>Installieren Sie alle notwendigen Softwarepakete zur Steuerung, Datenerfassung, Verarbeitung und Auswertung gemäß den Anweisungen im Herstellerhandbuch.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Signalverbindungen zwischen dem AF4-System und dem UV-Vis-Detektor hergestellt wurden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die etablierten AF4-UV-vis-Verbindungen dicht und ohne Leckagen sind, indem Sie das Setup mit Reinstwasser (UPW) für 15 min spülen (Spitzendurchfluss 1 mL-min-1, Fokusdurchfluss 1 mL-min-1und Querdurchfluss rate 1,5 ml-min-1). Öffnen Sie dazu die Steuerungssoftware AF4 und geben Sie die Durchflussraten in die entsprechenden Panels auf der rechten oberen Seite der Zielseite ein. Ziehen Sie ggf. die entsprechenden Anschlüsse (Fittings) fest und wiederholen Sie den Vorgang, bis keine Leckagen erkennbar sind. HINWEIS: Der interne Systemdruck bei allen Messungen sollte überwacht werden und muss innerhalb von 4 bis 12 bar liegen. Wenn der Druck höher oder niedriger ist, müssen die Rückdruckschläuche angepasst werden. Darüber hinaus sollte der Kanaldrucktrend über die gesamte Messzeit konstant sein. HINWEIS: Wenn ein Kanalofen verfügbar ist, stellen Sie seine Temperatur auf 25 °C ein, um vergleichbare Messbedingungen während aller AF4-Experimente zu gewährleisten.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Lösungen und Suspensionen für DIE AF4-UV-vis Systemqualifizierung und Probenanalyse
<ol><li>Reinigungslösung<ol>
<li>8 g festes Natriumhydroxid (NaOH) und 2 g Natriumdodecylsulfat (SDS) zu 1 L UPW geben und die Lösung bis zur vollständigen Auflösung rühren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluent<ol>
<li>Fügen Sie 500 l gefiltertes Tensidgemisch zu 2 L gefiltertem und entgastem UPW hinzu, um das Eluent (0,025% (v/v), pH-Wert um 9,4 zu erhalten. ANMERKUNG: Eine detaillierte Beschreibung der Verbindungen des Tensidgemisches ist in Tabelle 1 (auch Materialtabelle) enthalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Willkürlicher AuNP-Größenstandard für die Massenrückgewinnungsbestimmung<ol>
<li>Vortex eine beliebige AuNP Größe Standard (50 mg-L -1) für 2 min und verdünnen Sie es 1:4 mit UPW, um eine endgültige Massenkonzentration von 12,5 mg-L-1zu erhalten. Wirbel für zusätzliche 2 min nach Verdünnung zur Homogenisierung der erhaltenen Suspension. VORSICHT: Bei der Arbeit mit Chemikalien, insbesondere NaOH-Pellets, sind notwendige Vorsichtsmaßnahmen und geeignete Schutzausrüstung erforderlich. HINWEIS: Es wird allgemein empfohlen, alle notwendigen Lösungen (mit Ausnahme der Reinigungslösung) mit einem 0,1 m-Membranfilter (hydrophiler PVDF oder ähnliches) zu entgasen und zu filtern, um einen geringen Partikelhintergrund während AF4-UV-vis-Experimenten zu gewährleisten. Dies kann entweder durch eine spezielle Vakuumfiltrationseinheit oder durch den Einsatz von Spritzenfiltern festgestellt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. AF4-UV-vis Systemqualifikation
<ol><li>Verwenden Sie die in Schritt 1.4 beschriebenen Softwareeinstellungen, um das System mit der Reinigungslösung für 30 min zu spülen (Tip-Durchflussrate 1mL-min -1, Fokusdurchflussrate 1 mL-min-1und Kreuzdurchfluss rate 1,5 ml-min -1).</li>
	<li>Ändern Sie die jeweilige Eluentflasche und spülen Sie das System mit UPW für 20 min (Tip-Durchfluss 1 mL-min-1, Fokusdurchfluss 1 mL-min-1, und Kreuzdurchfluss 1,5 mL-min -1).</li>
	<li>Ersetzen Sie die entsprechenden Inline-Pumpenfilter.</li>
	<li>Öffnen Sie die AF4-Patrone und ersetzen Sie die AF4-Membran. Setzen Sie die AF4-Patrone wieder zusammen und schließen Sie sie wieder mit dem AF4-UV-vis-System an.</li>
	<li>Spülen Sie das gereinigte AF4-UV-vis-System mindestens 30 min mit dem Eluent, um die Membran auszudemt und das System zu stabilisieren (Tip-Durchflussrate 1 mL-min-1, Fokusdurchfluss rate 1 mL-min-1, und Kreuzdurchfluss rate 1,5 ml-min-1). Überprüfen Sie erneut auf mögliche Leckagen (siehe Schritt 1.4).</li>
	<li>Qualifizieren Sie das AF4-UV-vis-System, indem Sie die Massenrückgewinnung und Variation der Retentionszeit mithilfe eines beliebigen AuNP-Größenstandards bestimmen.<ol>
<li>Führen Sie einen Direkteinspritzlauf ohne Anwendung einer Trennkraft durch.<ol>
<li>Erstellen einer neuen Messdatei durch Öffnen der Datei| Neue | Führen Sie in der STEUERUNGSsoftware AF4 aus.</li>
			<li>Definieren Sie die Beispiel- und Messbeschreibung sowie das Injektionsvolumen und den Beispielnamen auf der Registerkarte Ausführen. Die Messbedingungen sind in Tabelle 2dargestellt.</li>
			<li>Legen Sie die Messparameter in der zweiten Tab-FFF-Methode gemäß Tabelle 2fest.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Messung zu starten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Führen Sie einen Fraktionierungslauf mit Anwendung einer Trennkraft (Cross Flow) durch.<ol>
<li>Definieren Sie die Fraktionierungsmethode, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, mithilfe der in Tabelle 3angegebenen Fraktionierungsbedingungen .</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Messung zu starten.</li>
			<li>Führen Sie die Messung im Quadruplicate durch. HINWEIS: Der erste Lauf zielt darauf ab, das System (d. h. die AF4-Membran) zu konditionieren und wird von der abschließenden Bewertung der Systemqualifikationsergebnisse ausgeschlossen. HINWEIS: Es wird empfohlen, alle generierten Ausführungsdateien zu speichern, indem Sie Datei-| Speichern Sie in der STEUERUNGSsoftware AF4.</li>
			<li>Betrachten Sie das AF4-UV-vis-System qualifiziert, wenn eine Massenwiederherstellung von >80% und eine Variation der Retentionszeit <2% für den beliebigen AuNP-Größenstandard erhalten wird.</li>
			<li>Wenn Sie einen Autosampler als Einspritzsystem verwenden, füllen Sie die Nadelwaschbehälterflasche des Autosamplers mit der gleichen Lösung, die durch das AF4-UV-vis-System gepumpt wird (z. B. Reinigungslösung, UPW oder entsprechendes Eluent), um optimale Laufbedingungen zu gewährleisten. Beim Wechsel des Eluents wird generell empfohlen, die Wiederausgleich des AF4-Systems zu verfolgen, indem das UV-vis-Detektorsignal überwacht wird, bis seine Ausgangsbasis konstant stabil bleibt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. AF4-UV-vis Probenanalyse
<ol><li>Bereiten Sie alle AuNP-Größenstandards für die externe Größenkalibrierung vor, indem Sie die jeweilige AuNP-Suspension (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, je 50 mg) vorstrichen. L-1) für 2 min und verdünnen Sie es 1:4 mit UPW, um eine endgültige Massenkonzentration von 12,5 mg l-1zu erhalten. Wirbel für zusätzliche 2 min nach Verdünnung zur Homogenisierung der erhaltenen Suspensionen.</li>
	<li>Bereiten Sie die unbekannte AuNP-Probe für die Analyse vor, die das gleiche Verfahren wie für die in Schritt 4.1 beschriebenen Kalibrierstandards anwendet.</li>
	<li>Führen Sie eine Direkteinspritzung aller AuNP-Größenstandards mit der in Tabelle 2dargestellten AF4-Methode durch.<ol>
<li>Geben Sie dazu die entsprechenden Werte, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind, an den entsprechenden Stellen in die Software des Herstellers ein, um die Trenn- und Beispielparameter zu definieren, und drücken Sie die Run-Taste, um das Experiment zu starten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fraktionieren Sie jeden AuNP-Größenstandard einzeln mit der in Tabelle 3 dargestellten AF4-Methode, um die externe Größenkalibrierungsfunktion festzulegen.<ol>
<li>Geben Sie die entsprechenden Werte, die in Tabelle 3 zusammengefasst sind, an den entsprechenden Stellen in die Software des Herstellers ein. Die Fraktionierungsmethode wird durch einen Fokussierschritt, mehrere Elutionsschritte und einen Spülschritt definiert. Nachdem Sie die Methode eingerichtet haben, drücken Sie die Schaltfläche Ausführen, um das Experiment zu starten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine Direkteinspritzung der unbekannten AuNP-Probe mit der in Tabelle 2dargestellten AF4-Methode durch.</li>
	<li>Führen Sie die Fraktionierung der unbekannten AuNP-Probe durch, indem Sie die in Tabelle 3aufgeführte AF4-Methode durchführen.</li>
	<li>Führen Sie alle in Abschnitt 3 und 4 genannten Messungen in dreifacher Ausfertigung durch, sofern nicht anders angegeben, um aussagekräftige und statistisch relevante Ergebnisse zu gewährleisten.<ol>
<li>50 mg-L-1 AuNP-Lagersuspensionen bei 4–8 °C vor Gebrauch lagern. Verdünnte AuNP Suspensionen werden vor der Anwendung ideal erweise innerhalb von 30 min zubereitet. HINWEIS: Vortexing ist in der Regel ausreichend und es ist keine Ultraschallbehandlung der Suspensionen erforderlich.</li>
		<li>Um eine Korrelation der Retentionszeit der unbekannten AuNP-Probe mit den für die AuNP-Größenstandards erhaltenen Aufbewahrungszeiten zu ermöglichen, messen Sie alle Proben mit der gleichen AF4-Methode. ANMERKUNG: Um konstante und gültige Trennbedingungen zu gewährleisten, schließen Sie den im Abschnitt Systemqualifizierung (siehe Schritt 3.6.2) beschriebenen Fraktionierungsschritt nach einer definierten Anzahl von Stichprobenmessungen (z. B. 10 Messungen) ein./wiederholen Sie ihn. Darüber hinaus zeichnen Sie den Systemdruck und die Standeswertstabilität des UV-Vis-Detektors auf. Sie sollten während eines kompletten AF4-UV-vis-Laufs stabil und konstant bleiben. HINWEIS: Ersetzen Sie in der Regel die Ultrafiltrationsmembran, wenn der UV-Vis-Detektor (oder Der MalS-Detektor (Multi Angle Light Scattering, falls verfügbar) einen erhöhten Geräuschpegel anzeigt oder die definierten Systemqualifizierungskriterien wie Rückgewinnung, Probenspitzenform oder Wiederholbarkeit fehlen (oder das AF4-UV-vis-System einem gründlichen Reinigungsverfahren unterzogen wurde). Unter den hier beschriebenen Bedingungen ist das qualifizierte AF4-UV-vis-System in der Regel für mindestens 50 Messungen mit derselben Membran stabil; Die Anzahl möglicher aufeinanderfolgender Messungen, die die definierten Qualitätskriterien erfüllen, kann jedoch je nach Probe, Probenmatrix und Eluentenzusammensetzung erheblich variieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Datenauswertung
<ol><li>Führen Sie die Massenwiederherstellungsberechnung entweder mit der Datenauswertungssoftware des AF4-UV-vis-Systemherstellers oder nach dem Export aller erforderlichen Rohdaten (d.h. UV-vis Peak Area) aus der jeweiligen Datenerfassungssoftware nach den Anweisungen im Herstellerhandbuch durch.<ol>
<li>Berechnen Sie die AuNP-Massenrückgewinnung, indem Sie die Bereiche unter den jeweiligen UV-Vis-Spitzen der Fraktionierungsmessung (AFractionation) und der Direktinjektionsmessung (EineDirekteinspritzung) mit der folgenden Gleichung vergleichen: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg"> HINWEIS: Bei einer Direktinjektionsmessung wird keine Trennkraft angewendet, so dass mögliche Wechselwirkungen einer Analytenart mit der Akkumulationswand vernachlässigt werden können. Die Fläche unter einem jeweiligen UV-Vis-Peak kann nach dem Beer-Lambert-Gesetz direkt mit der AuNP-Masse korreliert werden, vorausgesetzt, dass keine andere Art innerhalb der Probe bei der jeweiligen Wellenlänge absorbiert und/oder i) Elutes zu einer anderen Retentionszeit unter Fraktionierungsbedingungen ii) durch die AF4-Membran entfernt wird.</li>
		<li>Importieren Sie die dat.-Dateien, die sowohl aus der Direktinjektion als auch aus dem Fractionation-Lauf gewonnen wurden.</li>
		<li>Wählen Sie die UV-Vis-Detektorspur auf der Registerkarte Übersicht aus.</li>
		<li>Definieren Sie eine Region of Interest (ROI) und eine Baseline in der Signal- und Basisansicht für alle Messungen.</li>
		<li>Setzen Sie eine Direkteinspritzung Überlageein.</li>
		<li>Wählen Sie alle Direktinjektionsläufe in der Ansicht "Direkte Injektionskalibrierungseinstellungen" aus und geben Sie einen UV-Aussterbekoeffizienten ein. HINWEIS: Es ist wichtig, den gleichen UV-Vis-Aussterbekoeffizienten sowohl für die Kalibrierung als auch für die Fraktionierungsmessung zu verwenden.</li>
		<li>Richten Sie die Kalibrierlinie unter Verwendung des Bereichs unter der UV-vis-Signalspur innerhalb des ROI und der aus der eingegebenen Konzentration und dem Injektionsvolumen berechneten injizierten Menge ein. Die erhaltene Kalibrierung wird im separaten Fenster der Direkteinspritzungskalibrierungsfunktion angezeigt.</li>
		<li>Weisen Sie die Kalibrierfunktion den jeweiligen Fraktionierungsmessungen zu. HINWEIS: Für jeden Kalibriergrößenstandard und die unbekannte AuNP-Probe muss aufgrund der größenabhängigen UV-Vis-Absorption von AuNP eine separate Kalibrierfunktion eingerichtet werden. Dieser Nachteil des UV-Vis-Detektors kann mit einem massenempfindlichen Detektor wie einem ICP-MS umgangen werden.</li>
		<li>Führen Sie die Analysen durch Einfügen einer Berechnung der quantitativen Ergebnisse durch, und die Ergebnisse werden in einer Tabelle auf der rechten Seite als Konzentrations- und injizierte Mengenwerte angezeigt.</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie die Variation der Aufbewahrungszeit mit der Datenauswertungssoftware des AF4-Systemherstellers oder nach dem Export aller erforderlichen Rohdaten (d.h. Aufbewahrungszeiten der AuNP-Kalibrierstandards zu den jeweiligen UV-vis-Spitzenmaxima und bzw. ungültigen Zeiten) aus der jeweiligen Datenerfassungssoftware nach den Anweisungen im Herstellerhandbuch.<ol>
<li>Öffnen Sie das Fenster Übersicht, um die entsprechenden UV-Spuren für alle importierten Messungen anzuzeigen.</li>
		<li>Die Spitzenerkennung wird automatisch durchgeführt; passen Sie die Spitzenerkennungsparameter in der Signalverarbeitungs-Toolbox an, um die Leistung zu optimieren. Extrahieren Sie die jeweilige Peak Maxima, indem Sie alle Messdateien durchgehen.</li>
		<li>Berechnen Sie die relative Standardabweichung für alle Messungen mit der folgenden Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg"> Die Berechnung kann auch mit einer entsprechenden Tabellenkalkulationssoftware durchgeführt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Größenermittlung entweder mit der vom Hersteller bereitgestellten Datenauswertungssoftware oder nach dem Export aller erforderlichen Rohdaten (Aufbewahrungszeit bei UV-vis-Maximale an alyte und bzw. ungültiger Zeit) aus der jeweiligen Datenerfassungssoftware nach den Anweisungen im Herstellerhandbuch durch. Eine externe Größenkalibrierungsfunktion kann ermittelt werden, indem die lückenhaften, korrigierten Aufbewahrungszeiten (Nettoretentionszeiten, siehe Tabelle 5)der AuNP-Größenstandards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) anhand ihrer hydrodynamischen Größen dargestellt werden, die aus zuvor durchgeführten DLS-Messungen ermittelt wurden (siehe Tabelle 4). HINWEIS: Die DLS-Messungen sollten idealerweise am selben Tag wie die jeweiligen Fraktionierungsmessungen durchgeführt werden, um vergleichbare Probeneigenschaften zu gewährleisten.<ol>
<li>Nach dem Import der .dat Werden alle Messungen auf der Registerkarte Übersicht angezeigt. Wählen Sie das UV-Vis-Detektorsignal aus der Detektorliste aus, das unter dem Overlay-Fenster angezeigt wird. Definieren Sie für jede Messung einen ROI und einen Basiswert, der in der Signal- und Baseline-Ansicht angepasst werden kann. Verwenden Sie die Signalverarbeitungs-Toolbox auf der rechten Seite, um laute Signale zu glätten. Verwenden Sie die Funktion Verarbeitungsparameter anderen Runs zuweisen, damit die Parameter anderen Messungen bzw. Signalen zugeordnet werden können.</li>
		<li>Wählen Sie die Partikelgrößenkalibrierung auf der Registerkarte Einfügen aus.</li>
		<li>Wählen Sie alle Kalibrierläufe aus, indem Sie im Tabellenteil Referenzen für Kalibrierung auswählen auf der oberen rechten Seite auf die jeweilige Messung klicken. Alle ausgewählten Messungen werden in einer Tabelle unten angezeigt. Geben Sie den hydrodynamischen Radius für alle Kalibrierungsmessungen ein, die in Tabelle 4angegeben sind. Die Funktion wird im Partikelgrößenkalibrierungsfenster – Funktionsfenster und die Gleichung angezeigt. HINWEIS: Der Korrelationskoeffizient (R2) der etablierten Größenkalibrierungsfunktion muss ≥0,990 betragen.</li>
		<li>Weisen Sie die Kalibrierungsfunktion den Messungen der unbekannten AuNP-Probe zu, indem Sie die entsprechenden Fraktionen in der Liste "Läufe für Zuweisung auswählen" auswählen.</li>
		<li>Zeigen Sie die Ergebnisse an, indem Sie eine Partikelgrößenverteilungsberechnung innerhalb der Registerkarte Einfügen öffnen. Die zuvor erstellte Partikelgrößenkalibrierung wird als Kalibrierung für die unbekannten AuNP-Probenmessungen aufgeführt, die in den rechten Fenstereinstellungenangezeigt wird. Die berechnete Größe wird im Größenverteilungsfenster angezeigt, das auf das maximale Spitzenmaximum beschriftet ist. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Durchschnittliche Signale für Sample, um alle Messungen einer Probe zu durchschnittlichen, und listen Sie das Ergebnis in der maximalen Höchstbeschriftung auf.</li>
		<li>Zeichnen Sie außerdem die Kalibrierungslinie über das Fractogramm, indem Sie das Kontrollkästchen Kalibrierungskurve anzeigen aktivieren. Eine kumulative Größenverteilung ist verfügbar, indem Sie das Kontrollkästchen Kumulative Verteilung anzeigen aktivieren. HINWEIS: Wenn Sie die Software des Herstellers für die Datenauswertung verwenden, wird empfohlen, alle Ergebnisse zu einem Bericht hinzuzufügen, der durch Klicken auf Bericht auf der Registerkarte Einfügen generiert werden kann. Die Schaltfläche Bericht fügt einem Dokument alle Ergebnisse, Tabellen und Diagramme hinzu. Auf der Registerkarte Bericht können die Berichtseinstellungen geändert werden, indem Sie die Berichtseinrichtung im Abschnitt Dokument öffnen.</li>
	</ol></li>
</ol>

Alle Autoren dieses Manuskripts sind Mitarbeiter der Postnova Analytics GmbH, deren Produkte in diesem Protokoll verwendet werden.

Die hydrodynamische Größe eines unbekannten AuNP wurde von AF4 genau bewertet, gekoppelt mit einem UV-Vis-Detektor mit genau definierten AuNP-Größenstandards von 20 nm bis 100 nm. Die entwickelte AF4-Methode wurde mit einem konstanten Cross-Flow-Profil optimiert, um eine lineare Beziehung zwischen gemessener Retentionszeit und AuNP-Größe herzustellen und so eine einfache Größenbestimmung aus der linearen Regressionsanalyse zu ermöglichen. Besonderes Augenmerk lag auch auf die Erreichung ausreichend hoher Rückgewinnungsraten, die auf keinen signifikanten Probenverlust während der Fraktionierung hindeuten, und darauf, dass die entwickelte AF4-Methode, einschließlich des angewendeten Eluenten und der Membran, gut mit allen fraktionierten AuNP-Proben übereinstimmte.
Die Methodenentwicklung ist wohl der wichtigste Schritt in AF4 und mehrere Parameter, einschließlich Kanalabmessungen, Strömungsparameter sowie Eluent, Membran, Abstandshöhe und sogar Probeneigenschaften müssen berücksichtigt werden, um die Fraktionierung innerhalb eines gegebenen Elutionszeitfensters zu verbessern. Der Zweck dieses Absatzes besteht darin, den Leser durch die kritischen Schritte zu führen, die optimiert wurden, um die Größe des unbekannten AuNP-Beispiels, das hier beschrieben wird, erfolgreich zu bestimmen. Für eine detailliertere Beschreibung der allgemeinen Entwicklung einer AF4-Methode wird der Leser auf den AF4-Abschnitt "ISO/TS21362:2018 - Nanotechnologien - Analyse von Nanoobjekten mit asymmetrischer Durchfluss- und Zentrifugalfeldflussfraktionierung"25verwiesen. Bei einem genaueren Blick auf die in Tabelle 3angegebenen angewandten Fraktionierungsbedingungen ist der erste kritische Schritt die Einführung und Entspannung der AuNP-Probe im AF4-Kanal. Dieser Schritt wird durch den Einspritzfluss, den Fokusfluss und den Querfluss gesteuert, deren Zusammenspiel die Probe zwingt, sich in der Nähe der Membranoberfläche zu lokalisieren und sie in einem schmalen Band in der Nähe des Injektionsports des AF4-Kanals zu konzentrieren, der im Grunde den Startpunkt der Fraktionierung definiert. Eine ausreichende Lockerung der Probe ist obligatorisch, da in diesem Schritt Probenbestandteile unterschiedlicher Größe in unterschiedlichen Höhen des AF4-Kanals lokalisieren und so die Grundlage für eine erfolgreiche Größenfraktionierung schaffen. Unvollständige Probenentspannung ist in der Regel durch eine erhöhte Hohlraumspitzenfläche sichtbar, die aus nicht zurückgehaltenen (d. h. nicht entspannten) Probenbestandteilen resultiert. Dieser Effekt kann durch eine Erhöhung der Injektionszeit und/oder der angewendeten Durchflussrate gemildert werden. Beide Parameter müssen jedoch sorgfältig optimiert werden, insbesondere für Proben, die anfällig für Agglomeration und Adsorption auf die AF4-Membran sind und durch die jeweiligen Rückgewinnungsraten für verschiedene Parametereinstellungen36,37überwacht werden können. Die angewendete Injektionszeit von 5 min zusammen mit einer Kreuzdurchflussrate von 1,0ml-min -1 ergab Rückgewinnungsraten >80% für alle AuNP-Proben und eine vernachlässigbare Hohlraumspitzenfläche, die nahezu optimale Entspannungsbedingungen anzeigt. Nach ausreichender Entspannung der AuNP-Probe wurde der Fokusstrom gestoppt und der Probentransport entlang der AF4-Kanallänge zum jeweiligen UV-Vis-Detektor eingeleitet, der den zweiten kritischen Schritt darstellt. Um eine ausreichend hohe Fraktionierungsleistung zu angemessenen Analysezeiten zu gewährleisten, wurde eine konstante Durchflussrate von 1,0 ml-min-1 für 30–50 min (abhängig vom jeweiligen fraktionierten AuNP-Größenstandard) gefolgt von einem 10 min linearen Querdurchflusszerfall bei einer Detektordurchflussrate von 0,5 ml.min-1 angewendet. Die Verwendung eines konstanten Cross-Flow-Profils über die Trennung aller AuNP-Größenstandards ergab eine lineare Beziehung zwischen Retentionszeit und AuNP-Größe nach FFF-Theorie22, wodurch die Größenbestimmung der unbekannten AuNP-Probe durch einfache lineare Regressionsanalyse ermöglicht wurde. Allerdings wurden andere Profile als ein konstanter Querfluss auch für die Dimensionierung von Nanopartikeln genutzt, was letztlich zu einer nichtlinearen Beziehung zwischen Retentionszeit und Partikelgröße38,39führt. Darüber hinaus ist die Größenbestimmung in AF4 mit genau definierten Größenstandards nicht auf AuNP beschränkt, sondern kann auch auf Nanopartikel mit anderen Größen und Elementarzusammensetzungen (z.B. Silber38,40 oder Kieselsäure-Nanopartikel41,42)angewendet werden. Darüber hinaus ist ICP-MS bei der Arbeit mit verdünnten Proben ein hochempfindlicher Elementardetektor, der mit AF4 gekoppelt werden kann, was die Vielseitigkeit dieses analytischen Ansatzes zur Dimensionierung einer Vielzahl von Nanopartikeln in Suspensionen ergänzt.
Trotz seiner weit verbreiteten Anwendung hat die externe Größenkalibrierung mit genau definierten Größenstandards in AF4 einige Besonderheiten, die bei der Verwendung für die genaue Dimensionierung unbekannter Proben berücksichtigt werden müssen. Zunächst beruht sie in hohem Maße auf der Anwendung vergleichbarer Bedingungen bei der Fraktionierung der jeweiligen Größennormen und der tatsächlichen Stichprobe. In dem hier dargestellten Fall ist es daher zwingend erforderlich, dass sowohl die AuNP-Größenstandards als auch die unbekannte AuNP-Probe nach der gleichen AF4-Methode sowie das gleiche Eluent und dieselbe Membran fraktioniert werden, was diesen Ansatz ziemlich unflexibel macht. Da keine größenempfindlichen Detektoren, z. B. Lichtstreuung (MALS und DLS), zur Hand sind, ist es zudem schwierig festzustellen, ob eine entsprechende AF4-Methode mit Größenstandards ausreichend gut funktioniert oder nicht. Dies gilt insbesondere für unbekannte Proben, die sehr große Größenverteilungen aufweisen, wobei unklar bleibt, ob alle Probenbestandteile dem normalen Elutionsmuster folgen: Fraktionierung von kleineren zu größeren Partikeln, oder ob größere Probenbestandteile bereits im sterisch-hyperlayer-Modus leuchten, wodurch potenziell mit kleineren Probenbestandteilen43,44ko-eluiert werden. Auch wenn die FFF-Theorie betont, dass AF4-Trennungen allein aufgrund von Unterschieden in der hydrodynamischen Größe mit Teilchen, die als Punktmassen betrachtet werden, ohne Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung22,eine andere Geschichte mit Partikel-Partikel- und Partikel-Membran-Wechselwirkungen (wie elektrostatische Anziehung/Abstoßung oder Van-der-Waals-Attraktion) spielen können und möglicherweise eine messbare Verzerrung in Größenbestimmung über externe Größenkalibrierung45,46einführen. Es wird daher empfohlen, Größennormen zu verwenden, die ideal auf die Zusammensetzung und die Oberflächeneigenschaften (Zeta-Potenzial) des Teilchens40,42 oder, wenn diese nicht verfügbar sind, zumindest gut charakterisierte Partikelgrößenstandards (z. B. Polystyrollatexpartikel) zu verwenden und ihre Vergleichbarkeit mit dem Teilchen von Interesse insbesondere hinsichtlich ihres Oberflächen-Zeta-Potenzials in der jeweiligen Umgebung, in dem die Analyse durchgeführt werden soll, sorgfältig zu bewerten41,47.
Die Vielseitigkeit von AF4 wird oft als seine größte Stärke angesehen, da es einen Anwendungsbereich bietet, der über die meisten anderen gängigen Größentechniken in diesem Bereich hinausgeht22,48,49. Gleichzeitig kann es aufgrund seiner damit verbundenen mutmaßlichen Komplexität auch als sein wichtigster Nachteil angesehen werden, insbesondere gegen schnelle und vorgeblich einfach zu bedienende Größentechniken wie DLS, Nanopartikel-Tracking-Analyse oder Single-Partikel-ICP-MS. Wenn man AF4 jedoch mit diesen populären Größentechniken relativiert, wird deutlich, dass alle Techniken ihre Vor- und Nachteile haben, aber alle tragen zu einem umfassenderen Verständnis der physikalisch-chemischen Natur von Nanopartikeln bei und sollten daher als komplementär und nicht als wettbewerbsfähig betrachtet werden.
Das hier vorgestellte Standard-Betriebsverfahren (SOP) unterstreicht die hervorragende Anwendbarkeit von AF4-UV-vis mit externer Größenkalibrierung für die Dimensionierung einer unbekannten AuNP-Probe in Suspension und wurde schließlich als empfohlene Richtlinie für die AF4-Analyse einer unbekannten AuNP-Probe im Rahmen eines internationalen Laborvergleichs (ILC) angewendet, der im Rahmen des Horizon 2020-Projekts ACEnano durchgeführt wurde (das Ergebnis dieser ILC wird Gegenstand einer zukünftigen Veröffentlichung sein). Dieses Protokoll ergänzt somit die ermutigenden und laufenden internationalen Bemühungen zur Validierung und Standardisierung der AF4-Methoden25,50,51,52 und unterstreicht das vielversprechende Potenzial von AF4 auf dem Gebiet der Nanopartikelcharakterisierung.

Gold-Nanopartikel (AuNP) in Form von kolloidalem Gold waren schon lange vor dem Verständnis der Nanopartikel und bevor der Begriff Nanopartikel seinen Weg in das zeitgenössische, wissenschaftliche Vokabular gefunden hatte, ein Teil der menschlichen Kultur gewesen. Ohne besondere Kenntnis ihres nanoskaligen Aussehens wurde die suspendierte AuNP bereits im alten China, Arabien und Indien im V-VI Jahrhundert1für medizinische und andere Zwecke verwendet, und auch die alten Römer nutzten ihre rubinrote Farbe, um ihre Keramik in der Lycurgus-Cup-Ausstellung im British Museum2zu färben. In der westlichen Welt, im Laufe der Jahrhunderte vom Mittelalter bis zur Neuzeit, suspendiert AuNP wurden vorwiegend als Farbstoffe für Glas und Emaille (Lila von Cassius)3 sowie zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten (Potable Gold), vor allem Syphilis4.
Jedoch, alle diese Studien hatten sich in erster Linie auf die Anwendung der ausgesetzten AuNP konzentriert und es war an Michael Faraday im Jahr 1857, den ersten rationalen Ansatz einzuführen, um ihre Bildung, ihre Art sowie ihre Eigenschaften zu untersuchen5. Obwohl Faraday bereits wusste, dass diese AuNP sehr winzige Dimensionen haben muss, war es erst die Entwicklung der Elektronenmikroskopie, als explizite Informationen über ihre Größenverteilung zugänglich waren6,7, was schließlich die Korrelation zwischen Größe und anderen AuNP-Eigenschaften ermöglichte.
Heute, dank ihrer ziemlich einfachen und einfachen Synthese, bemerkenswerten optischen Eigenschaften (Oberflächen-Plasmonresonanz), gute chemische Stabilität und damit geringe Toxizität sowie ihre hohe Vielseitigkeit in Bezug auf verfügbare Größen und Oberflächenmodifikationen, AuNP haben weit verbreitete Anwendungen in Bereichen wie Nanoelektronik8, Diagnostik9, Krebstherapie10oder Medikamentenabgabe11gefunden. Natürlich ist für diese Anwendungen die genaue Kenntnis der Größe und Größenverteilung des angewandten AuNP eine Grundvoraussetzung, um eine optimale Wirksamkeit zu gewährleisten12, und es besteht ein erheblicher Bedarf an robusten und zuverlässigen Werkzeugen zur Bestimmung dieses entscheidenden physikalisch-chemischen Parameters. Heute gibt es eine Vielzahl von Analytischen Techniken, die AuNP in Suspension dimensionieren können, einschließlich, zum Beispiel UV-vis-Spektroskopie (UV-vis)13, Dynamic Light Scattering (DLS)14 oder Single Particle Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (spICP-MS)15 mit Field-Flow Fractionation (FFF) als Schlüsselakteur in diesem Bereich16,17,18,19,20.
Erstmals 1966 von J. Calvin Giddings21konzipiert, umfasst FFF eine Familie von elutionsbasierten Fraktionierungstechniken, bei denen die Trennung innerhalb eines dünnen, bandartigen Kanals ohne stationäre Phase22,23stattfindet. In FFF wird die Trennung durch die Wechselwirkung einer Probe mit einem externen Kraftfeld induziert, das senkrecht zur Richtung eines laminaren Kanalflusses wirkt, bei dem die Probe in der Regel flussabwärts zu den jeweiligen Inline-Detektoren transportiert wird. Unter diesen verwandten FFF-Techniken ist die asymmetrische Durchflussfeld-Flussfraktion (AF4), bei der ein zweiter Durchfluss (Kreuzfluss) als Kraftfeld fungiert, zum am häufigsten verwendeten Subtyp24geworden. In AF4 ist der Kanalboden (Akkumulationswand) mit einer halbdurchlässigen Ultrafiltrationsmembran ausgestattet, die in der Lage ist, die Probe zu halten und gleichzeitig den Querfluss durch die Membran passieren zu lassen und den Kanal über einen zusätzlichen Ausgang zu verlassen. Auf diese Weise kann der Querstrom die Probe zur Akkumulationswand schieben und so ihrem diffusionsinduzierten Fluss (Brownsche Bewegung) entgegenwirken. In einem resultierenden Gleichgewicht von feld- und diffusionsinduzierten Flussarten; kleinere Probenbestandteile mit höheren Diffusionskoeffizienten richten sich näher am Kanalzentrum aus, während größere Probenbestandteile mit niedrigeren Diffusionskoeffizienten näher an der Akkumulationswand liegen. Durch das parabolische Strömungsprofil innerhalb des Kanals werden daher kleinere Probenbestandteile in den schnelleren Laminaen des Kanalflusses transportiert und vor größeren Probenbestandteilen elute. Mit FFF-Retentionsparametern und Stokes-Einstein-Diffusionskoeffizientengleichungen können dann die Elutionszeit bzw. das Elutionsvolumen einer Probe in AF4 direkt in ihre hydrodynamische Größe22übersetzt werden. Hier bezieht sich das beschriebene Elutionsverhalten auf den normalen Elutionsmodus und gilt in der Regel für AF4 innerhalb eines Partikelgrößenbereichs zwischen ca. 1–500 nm (manchmal bis zu 2000 nm je nach Partikeleigenschaften und Fraktionierungsparametern), während die sterisch-hyperlayerElution in der Regel oberhalb dieses Größenschwellenwerts25auftritt.
Es gibt drei gängige Möglichkeiten, Größeninformationen nach der Trennung durch FFF abzuleiten. Da FFF ein modulares Instrument ist, kann es nachgeschaltet mit mehreren Detektoren wie größenempfindlichen Lichtstreudetektoren nach dem Prinzip der Multi-Angle Light Scattering (MALS)26,27, Dynamic Light Scattering (DLS)28,29oder sogar einer Kombination aus beidem kombiniert werden, um zusätzliche Forminformationen zu erhalten30,31. Da jedoch das Retentionsverhalten einer Probe in einem FFF-Kanal im Allgemeinen durch genau definierte physikalische Kräfte gesteuert wird, kann die Größe auch mit einem mathematischen Ansatz (FFF-Theorie) berechnet werden, bei dem ein einfacher Konzentrationsdetektor (z.B. ein UV-Vis-Detektor) ausreicht, um das Vorhandensein einer eluierenden Probe32,33anzuzeigen.
Als dritte Option berichten wir hier über die Anwendung einer externen Größenkalibrierung34,35 unter Verwendung klar definierter AuNP-Standards im Größenbereich von 20–100 nm für die Dimensionierung einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe in Suspension mit AF4 gekoppelt mit UV-Vis-Detektion. Dieses einfache Versuchsgebildt wurde absichtlich gewählt, um möglichst vielen Laboratorien die Teilnahme an einem internationalen Interlaborationsvergleich (ILC) zu ermöglichen, der später im Rahmen des Horizont-2020-Projekts ACEnano der Europäischen Union auf der Grundlage des hier vorgestellten Protokolls durchgeführt wurde.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-FIL-TEF-002</td>
			<td>Used for filtration of aqueous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Durapore Millex</td>
			<td>Used for filtration of NovaChem100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Research Plus</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 cartridge</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ENTRIS124I-1S</td>
			<td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN5300</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel Oven</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN4020</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossflow Module</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF Control Module</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>ep T.I.P.S</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>1-0199</td>
			<td>Used for eluent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1131</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>VIA-002</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaCal Gold</td>
			<td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VIBRAX-VXR</td>
			<td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal Computer (PC)</td>
			<td>Dell Technologies</td>
			<td>/</td>
			<td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>In accordance with respective laboratory&#8217;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-VIA-09150868</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &#8805;99 %, Blotting Grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>2326.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &#8805;98 %, p.a</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Control and Data Acquisition</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaFFF AF2000 Software</td>
			<td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Data Evaluation</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaAnalysis Software</td>
			<td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for final Data Processing</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Origin 2019</td>
			<td>Used for final data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Degasser</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7520</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Selector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7310</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Organizer</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7140</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant Mixture</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaChem100</td>
			<td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1130</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unknown AuNP sample</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC60</td>
			<td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis Detector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN3211</td>
			<td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration Unit</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Eluent Filtration System</td>
			<td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Milli-Q Integral 5</td>
			<td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&#937;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

Die Partikelgröße ist wohl der wichtigste physikalisch-chemische Parameter, der mit dem Begriff eines Nanopartikels verbunden ist. Genaue Kenntnisse der Größe und Größenverteilung von Nanopartikeln sind für verschiedene Anwendungen von größter Bedeutung. Der Größenbereich ist ebenfalls wichtig, da er die "aktivste" Komponente einer Nanopartikeldosis definiert.
Asymmetrische Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung (AF4) ist eine leistungsstarke Technik zur Dimensionierung von Partikeln in Suspension im Größenbereich von ca. 1–1000 nm. Es gibt mehrere Möglichkeiten, Größeninformationen aus einem AF4-Experiment abzuleiten. Neben der Online-Kopplung von AF4 mit größenempfindlichen Detektoren, die auf den Prinzipien der Multi-Angle Light Scattering oder Dynamic Light Scattering basieren, besteht auch die Möglichkeit, die Größe einer Probe mit ihrer Retentionszeit nach einem etablierten theoretischen Ansatz (FFF-Theorie) oder durch vergleicht es mit den Retentionszeiten von genau definierten Partikelgrößenstandards (externe Größenkalibrierung) zu korrelieren.
Wir beschreiben hier die Entwicklung und interne Validierung eines Standard-Betriebsverfahrens (SOP) zur Dimensionierung einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe durch AF4 gekoppelt mit UV-Vis-Detektion mittels externer Größenkalibrierung mit Gold-Nanopartikel-Standards im Größenbereich von 20–100 nm. Dieses Verfahren bietet eine detaillierte Beschreibung des entwickelten Workflows einschließlich Probenvorbereitung, AF4-Instrumentenaufbau und -Qualifizierung, AF4-Methodenentwicklung und -Fraktionierung der unbekannten Gold-Nanopartikelprobe sowie die Korrelation der erhaltenen Ergebnisse mit der etablierten externen Größenkalibrierung. Das hier beschriebene SOP wurde schließlich im Rahmen einer interlaborativen Vergleichsstudie erfolgreich validiert, die die hervorragende Robustheit und Zuverlässigkeit von AF4 für die Dimensionierung von Nanopartikelproben in Suspensionen hervorhebt.

Zunächst wurden die AuNP-Größenstandards durch AF4 fraktioniert und durch UV-vis-Messung der Absorption der AuNP bei einer Wellenlänge von 532 nm (Oberflächen-Plasmonresonanz von AuNP) nachgewiesen. Eine Überlagerung der erhaltenen Fraktogramme ist in Abbildung 1dargestellt. Die Retentionszeiten jedes AuNP an seinem jeweiligen UV-Vis-Spitzenmaximum, das aus dreifachen Messungen gewonnen wird, sind in Tabelle 5aufgeführt. Die relative Standardabweichung aller Retentionszeiten lag unter 1,1% bei abnehmender Messabweichung mit zunehmender Größe. Insgesamt wurde eine hervorragende Wiederholbarkeit erreicht. Es wurde eine konstante Trennkraft angewendet, die zu einem linearen Verhältnis von Elutionszeit und hydrodynamischer Größe führte. Die externe Größenkalibrierungslinie wurde durch Plotten des angegebenen hydrodynamischen Radius gegen die nullzeit korrigierte Elutionszeit (Netto-Retentionszeit) ermittelt. Eine lineare Regressionsanalyse ergab eine lineare Kalibrierfunktion mit einem Intercept a = -3,373 nm ± 1,716 nm und einer Steigung b = 1,209nm-min -1 ± 0,055 nm'min-1. Das lineare Verhalten der Elution wurde mit einem quadrierten Korrelationskoeffizienten R2 von 0,9958 bestätigt. Die jeweilige Kalibrierfunktion wird in Abbildung 2visuell dargestellt.
Der zweite Teil befasste sich mit der Analyse der unbekannten AuNP-Probe. Drei Aliquots der Probe wurden nach dem im Protokollabschnitt beschriebenen Verfahren (Abschnitt 4.2) erstellt. Jeder der drei Aliquots wurde in Dreifacharbeit mit der gleichen AF4-Fraktionierungsmethode untersucht, die auch für die AuNP-Größenstandards angewendet wurde. Alle neun AF4-UV-vis-Fraktogramme, die aus der unbekannten AuNP-Probe gewonnen wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt und ihre jeweiligen Auswertungen sind in Tabelle 6zusammengefasst. Die relative Standardabweichung der jeweiligen Retentionszeiten war signifikant gering und lag zwischen 0,1% und 0,5%. Mit Der Partikelgrößenkalibrierungsfunktion, die aus der Fraktionierung der AuNP-Größenstandards gewonnen wurde und sie mit den erhaltenen Retentionszeiten der unbekannten AuNP-Probe am UV-vis-Spitzenmaximum korreliert, konnte ein durchschnittlicher hydrodynamischer Gesamtradius von 29,4 nm ± 0,2 nm berechnet werden. Darüber hinaus wurde eine angemessene Massenrückgewinnung von 83,1 % ± 1,2 % erzielt, was auf keine signifikante Agglomeration oder Auflösung der AuNP-Probe oder eine erhebliche Adsorption von Partikeln auf die Membranoberfläche hindeutet. Abbildung 4 zeigt die erhaltene Partikelgrößenverteilung mit allen neun UV-vis-Signalspuren, die im Durchschnitt die hervorragende Robustheit der angewendeten AF4-Methode hervorheben.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> Abbildung 1: AF4-UV-vis Fraktogramme, die aus der dreifachen Analyse der vier einzelnen AuNP-Größenkalibrierungsstandards mit normalisierten Signalintensitäten und angewendeter konstanter Durchflussrate (schwarze Linie) gewonnen werden. Die Leertaste wird in etwa 5,9 min grau hervorgehoben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> Abbildung 2: Erhaltene externe Größenkalibrierungsfunktion, einschließlich Fehlerbalken, die aus den jeweiligen Standardabweichungen der DLS-Messungen (Tabelle 4) und Varianzen in den erhaltenen AF4-Retentionszeiten (Tabelle 5) abgeleitet wurden, nachdem der angegebene hydrodynamische Radius mit der Retentionszeit jedes einzelnen AuNP-Größenkalibrierungsstandards an seinem jeweiligen Spitzenmaximum dargestellt wurde. Aus einer linearen Regressionsanalyse wurde eine lineare Kalibrierfunktion mit Standardfehlern in Form von y = a + bx mit a = -3.373 nm ± 1.716 nm und b = 1.209 nm'min-1 ± 0.055 nm'min-1 berechnet. Es wurde ein quadrierter Korrelationskoeffizient mit R2 = 0,9958 ermittelt, der auf eine lineare Beziehung hinweist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> Abbildung 3: AF4-UV-vis Fractogramme von dreifachen Messungen von drei Aliquots, die das unbekannte AuNP anzeigen. Der angewendete konstante Durchflussüberfluss über die Messzeit wird als schwarze Linie dargestellt. Der Leerstrich bei etwa 5,9 min wird grau hervorgehoben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> Abbildung 4: Überlagerung der erhaltenen durchschnittlichen Partikelgrößenverteilung (rot) der unbekannten AuNP-Probe und der angewendeten linearen Kalibrierfunktion (gepunktete Linie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Komponente</td>
			<td>CAS-Nr.</td>
			<td>Gewicht (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Wasser</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-Octadecenoic acid (Z)-, Verbindung mit 2,2',2''-Nitrilotris[Ethanol](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Natriumcarbonat</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Alkohole, C12-14-sekundär, ethoxyliert</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tetranatrium EDTA</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Polyethylenglykol</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Natriumoleat</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Natriumbicarbonat</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Liste der Bestandteile des Tensidgemisches, das zur Herstellung des Eluentenverwendeters verwendet wird (siehe auch Werkstofftabelle).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis Parameter</td>
			<td>Einheit</td>
			<td>Wert</td>
		</tr>
<tr>
<td>Abstandsstärke</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detektordurchfluss</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kreuzdurchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0 (konstant für 8 min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fokusdurchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verzögerungszeit / Stabilisierungszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionsdurchfluss</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Übergangszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elutionsschritt</td>
			<td>Min</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spülen Sie Schrittzeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spülen Schritt durchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionsvolumen</td>
			<td>Μl</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Probenkonzentration</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membrantyp</td>
			<td></td>
			<td>Regenerierte Cellulose</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membran-Molekulargewichts-Cut-off</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluent</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) Tensidmischung</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis Wellenlänge</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-Vis-Empfindlichkeit</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Zusammenfassung der Parameter der AF4-UV-vis-Fraktionierungsmethode zur Durchführung des Direkteinspritzlaufs ohne Anwendung einer Trennkraft.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis Parameter</td>
			<td>Einheit</td>
			<td>Wert</td>
		</tr>
<tr>
<td>Abstandsstärke</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detektordurchfluss</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kreuzdurchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1 (60 min konstant, 10 min linear)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fokusdurchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verzögerungszeit / Stabilisierungszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionsdurchfluss</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Übergangszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionszeit</td>
			<td>Min</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Elutionsschritt</td>
			<td>Min</td>
			<td>70 (60 min konstant, 10 min linear)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spülschritt</td>
			<td>Min</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spülen Schritt durchflussrate</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Injektionsvolumen</td>
			<td>Μl</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Probenkonzentration</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membrantyp</td>
			<td></td>
			<td>Regenerierte Cellulose</td>
		</tr>
<tr>
<td>Membran-Molekulargewichts-Cut-off</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluent</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) Tensidmischung</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis Wellenlänge</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-Vis-Empfindlichkeit</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Zusammenfassung der Parameter der AF4-UV-vis-Fraktionierungsmethode, um den Fraktionierungslauf unter Anwendung eines Querflusses als Trennkraft durchzuführen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kalibrierstandard</td>
			<td>Verschlussmittel</td>
			<td>Mittlere Größe (TEM) (nm)</td>
			<td>Lebenslauf (mittlere Größe TEM) (%)</td>
			<td>Zeta-Potenzial (mV)</td>
			<td>SD (Zetapotential) (mV)</td>
			<td>Hydrodynamischer Radius (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (hydrodynamischer Radius) (nm)</td>
			<td>Pdi</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>Citrat</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>Citrat</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>Citrat</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>Citrat</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Zusammenfassung der physikalisch-chemischen Parameter der angewandten AuNP-Kalibrierstandards, einschließlich Verschlussmittel, TEM-Mittelgröße, Zeta-Potenzial, das in der nativen Suspension bestimmt wird, sowie des hydrodynamischen DLS-Radius und des im Eluent ermittelten Polydispersitätsindex (PDI).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kalibrierstandard</td>
			<td>Ausführen</td>
			<td>Retentionszeit bei Maximaler Höchstgeschwindigkeit (min)</td>
			<td>Netto-Retentionszeit bei Maximaler Spitze (min)</td>
			<td>Durchschnittliche Netto-Einbehaltungszeit (min)</td>
			<td>SD (%) (Netto-Aufbewahrungszeit)</td>
			<td>SD (min) (Netto-Aufbewahrungszeit)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 5: Retentionszeiten der AuNP-Kalibrierstandards am jeweiligen UV-Vis-Spitzenmaximum abgeleitet aus den jeweiligen AF4-UV-vis Fraktogrammen nach dem in Tabelle 3beschriebenen Verfahren.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aliquote</td>
			<td>Ausführen</td>
			<td>Haltezeit maximum (min)</td>
			<td>Durchschnittliche Retentionszeit bei Höchstgeschwindigkeit (min)</td>
			<td>Netto-Retentionszeit bei Maximaler Spitze (min)</td>
			<td>SD (%) Aufbewahrungszeit</td>
			<td>Hydrodynamischer Radius (nm)</td>
			<td>Erholung (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 6: Zusammenfassung der Retentionszeiten am jeweiligen UV-Vis-Spitzenmaximum, des hydrodynamischen Radius, der aus der externen Größenkalibrierung berechnet wird (Abbildung 2) und der Rückgewinnungsrate der unbekannten AuNP-Probe aus der AF4-UV-vis-Analyse.

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Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von asymmetrischer Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung in Verbindung mit UV-vis-Detektion zur Bestimmung der Größe einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe.

Asymmetrische Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung zur Dimensionierung von Gold-Nanopartikeln in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.0K Aufrufe.  Postnova Analytics GmbH. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von asymmetrischer Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung in Verbindung mit UV-vis-Detektion zur Bestimmung der Größe einer unbekannten Gold-Nanopartikelprobe.

Serie: Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Forschung

Biotechnik

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Quantifizierung der globalen diastolischen Funktion durch kinematische Modellierung basierende Analyse der transmitralen Fluss über die diastolische Füllung Parametrisierte Formalismus

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

Herstellung von Metallnanopartikeln durch gepulste Laserablation in Flüssigkeiten: Ein Werkzeug zum Studium der antibakteriellen Eigenschaften von Nanopartikeln

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

Protein Kinase C-Delta-Inhibitor Peptid Formulierung mit Gold-Nanopartikeln

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash-NanoPrecipitation für die Kapselung der hydrophoben und hydrophilen Verbindungen in Polymeren Nanopartikel

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...