著者らは、ここで提示されたプロトコルの準備のすべての段階を通じて実りある議論のためにACEnanoコンソーシアム全体に感謝したいと思います。著者らはまた、ACEnanoプロジェクトの枠組みの中で助成金契約nº 720952の下で欧州連合ホライゾン2020プログラム(H2020)からの資金を高く評価する。

1. AF4システムのセットアップ
<ol><li>製造元のマニュアルに記載されている指示に従って、AF4カートリッジを組み立て、AF4システムとUV-vis検出器(材料表)のすべてのハードウェアコンポーネントを接続します。</li>
	<li>メーカーのマニュアルに記載されている指示に従って、制御、データ収集、処理、評価に必要なすべてのソフトウェアパッケージをインストールします。</li>
	<li>AF4システムとUV-vis検出器の間に必要な信号接続がすべて確立されていることを確認します。</li>
	<li>確立されたAF4-UV-vis接続が15分間の超純水(UPW)でセットアップを流すことによって、密着性と漏れがないことを確認してください(チップフローレート1 mL∙min-1、フォーカス流量1mの∙min-1、クロスフローレート1.5 mL min-1)。これを行うには、AF4 コントロール ソフトウェアを開き、ランディング ページの右上にあるそれぞれのパネルに流量を入力します。必要に応じて、それぞれのコネクタ(継手)を締め、漏れが発生しなくなるまで手順を繰り返します。 注: すべての測定中の内部システム圧力は監視する必要があり、4 から 12 のバーの範囲内になければなりません。圧力が高いか低い場合は、背圧チューブを調整する必要があります。さらに、チャネル圧力の傾向は、完全な測定時間にわたって一定である必要があります。 注:チャネルオーブンが利用可能な場合は、すべてのAF4実験を通して同等の測定条件を確保するために、その温度を25°Cに設定してください。</li>
</ol>2. AF4-UV-visシステムの認定およびサンプル分析のためのソリューションとサスペンションの調製
<ol><li>洗浄液<ol>
<li>8gの水酸化ナトリウム(NaOH)と2gのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を1LのUPWに加え、完全に溶解するまで溶液をかき混ぜる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>溶 離 液<ol>
<li>500 μLの濾過された界面活性剤混合物を2 Lの濾過および脱ガスされたUPWに加え、溶出液(0.025%(v/v)、pHを9.4の周りに得る。 注: 界面活性剤混合物の化合物の詳細な説明は、表1(表の材料も含む)に示されています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>大量回収測定のための任意のAuNPサイズ標準<ol>
<li>ボルテックスは、任意のAuNPサイズ標準(50mg∙L-1)を2分間、UPWで1:4希釈して12.5mg∙L-1の最終質量濃度を得る。渦は、希釈後2分間、得られた懸濁液を均質化する。 注意:化学物質、特にNaOHペレットを扱う場合は、必要な予防措置と適切な保護具が必要です。 注:AF4-UV-vis-実験中に低粒子の背景を確保するために、0.1 μmの膜フィルター(親水性PVDFまたは類似)を使用して、必要なすべての溶液(洗浄液を除く)を脱ガスおよびフィルタリングすることが一般的に推奨されます。これは、専用の真空ろ過ユニットまたはシリンジフィルターを使用して確立することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. AF4-UV-visシステムの資格
<ol><li>ステップ 1.4 で説明したソフトウェア設定を使用して、システムを 30 分間の洗浄液で洗い流します (チップ流量 1 mL∙min-1、フォーカス流量 1 mL∙min-1、およびクロス流量 1.5 mL∙分-1)。</li>
	<li>それぞれの溶出ボトルを変更し、20分間UPWでシステムをフラッシュします(チップ流量1 mL∙min-1、フォーカス流量1mL∙min-1、およびクロス流量1.5 mL∙分-1)。</li>
	<li>それぞれのインラインポンプフィルタを交換してください。</li>
	<li>AF4カートリッジを開き、AF4膜を交換してください。AF4カートリッジを再組み立て、AF4-UV-visシステムに再接続します。</li>
	<li>洗浄したAF4-UV-visシステムを、膜を平衡化してシステムを安定化させるために、少なくとも30分間溶出して洗浄したAF4-UV-visシステムをフラッシュします(先端流量1 mL∙min-1、フォーカス流量1mの∙min-1、クロス流量1.5mL分-1)。漏れの可能性を再度確認します(ステップ1.4を参照)。</li>
	<li>任意のAuNPサイズ規格を使用して、質量回収と保持時間の変動を決定することにより、AF4-UV-visシステムを修飾します。<ol>
<li>分離力を適用せずに直接注入を実行します。<ol>
<li>[ファイル] |を開いて新しい測定 ファイルを作成する新しい| AF4制御ソフトウェアで実行します。</li>
			<li>サンプルと測定の説明、射出量とサンプル名を [実行 ]タブで定義します。測定条件は 表 2に表示されます。</li>
			<li>表 2に従って、2 番目のタブFFF メソッドで測定パラメータを設定します。</li>
			<li>[ 実行 ]ボタンをクリックして、測定を開始します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>分離力(クロスフロー)の適用で分数を実行します。<ol>
<li>表 3で指定した分数条件を使用して、前のセクションで説明した分数法を定義します。</li>
			<li>[ 実行 ]ボタンをクリックして、測定を開始します。</li>
			<li>測定を4倍にして行います。 注:最初の実行は、システム(すなわち、AF4膜)のコンディショニングを目的とし、システム資格の最終評価から除外されます。 注: ファイル |を開いて、生成されたすべての実行ファイル を 保存することをお勧めしますAF4制御ソフトウェアで 保存 します。</li>
			<li>任意の AuNP サイズ標準に対して 、>80% の質量回復と保持時間の変動 <2% が得られる場合は、AF4-UV-vis-システムの修飾を検討してください。</li>
			<li>オートサンプラーを注入システムとして使用する場合は、オートサンプラーの針洗浄リザーバーボトルに、AF4-UV-visシステムを介してポンプで送り込まれるのと同じ溶液(例えば、洗浄液、UPW、またはそれぞれの溶片)を充填して、最適な走行条件を確保します。溶出性を変化させる場合、一般的に、そのベースラインが一定のレベルで安定するまでUV-vis-detector信号を監視することによって、AF4系の再平衡化に従うことを推奨する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. AF4-UV-vis サンプル解析
<ol><li>それぞれのAuNP懸濁液(20nm、40 nm、80 nm、100 nm、各50mg)をボルテックスすることにより、外部サイズキャリブレーションのすべてのAuNPサイズ標準を準備します。L-1)を2分間にし、UPWで1:4に希釈して、最終的な質量濃度12.5 mg∙L-1を得る。得られた懸濁液を均質化するために希釈後2分間のボルテックスを追加する。</li>
	<li>ステップ 4.1 で説明した校正標準と同じ手順を適用して、未知の AuNP サンプルを分析用に準備します。</li>
	<li>表2に示したAF4法を用いて、全てのAuNPサイズ規格の直接注入測定を行う。<ol>
<li>これを行うには、 表 2 に要約したそれぞれの値を製造元のソフトウェアに適切な位置に入力して、分離パラメータとサンプル パラメータを定義し、[ 実行 ]ボタンを押して実験を開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>表3に表示されているAF4方式を用いて、各AuNPサイズ標準を個別に分数し、外部サイズ調整機能を確立する。<ol>
<li>表 3に要約したそれぞれの値を、製造元のソフトウェアの適切な位置に入力します。分数法は、焦点合わせステップ、いくつかの溶出ステップ、およびリンスステップによって定義される。メソッドを設定したら、実行ボタンを押して実験を開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>表2に表示されているAF4法を用いて未知のAuNPサンプルの直接注入測定を行う。</li>
	<li>表3に示したAF4法を実施して未知のAuNPサンプルの分画を行う。</li>
	<li>意味のある統計的に関連する結果を確実にするために特に明記されていない限り、 セクション3 および 4 に記載されているすべての測定を三重に実行する。<ol>
<li>50 mg の∙L-1 AuNP の在庫の使用前に 4 – 8 °C で保管してください。希釈されたAuNP懸濁液は、塗布前に30分以内に理想的に調製されます。 注:ボルテックスは通常十分であり、懸濁液の超音波は必要ありません。</li>
		<li>未知のAuNPサンプルの保持時間と、AuNPサイズ規格で得られた保持時間との相関を可能にするために、同じAF4法を用いてすべてのサンプルを測定する。 注: 一定の有効な分離条件を保証するには、サンプル測定の定義された数(例えば、10回の測定)の後に、システムの認定セクションで説明されている分数ステップを含める/繰り返します(ステップ3.6.2を参照)。さらに、記録システム圧力およびUV-vis検出器のベースライン安定性。それらは完全なAF4-UV-visの実行に沿って安定し、一定であるべきである。 注: 通常、UV-vis 検出器(またはマルチアングル光散乱(MALS)検出器がノイズレベルの増加を示す場合、または回復、サンプルピーク形状、または再現性などの定義されたシステムの認定基準が見つからない場合(または AF4-UV-vis-system が徹底的な洗浄手順を行った場合)、限外濾過膜を交換します。ここで説明する条件下では、修飾されたAF4-UV-visシステムは、通常、同じ膜を使用して少なくとも50の測定のために安定しています。ただし、定義された品質基準を満たす連続測定の数は、サンプル、サンプルマトリックス、および溶出性の組成によって大きく異なる場合があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. データ評価
<ol><li>AF4-UV-visシステムメーカーが提供するデータ評価ソフトウェアを使用して、またはメーカーのマニュアルに記載されている指示に従って、それぞれのデータ取得ソフトウェアから必要なすべての生データ(すなわち、UV-visピーク領域)をエクスポートした後のスプレッドシート分析のいずれかを使用して、質量回収計算を実行します。<ol>
<li>次の式を使用して、分別測定の各 UV-vis ピークの下の領域 (分別) と直接射出測定 (A直接注入) を比較して、AuNP 質量回復を計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg"> 注: 直接注入の測定中は、分離力は適用されないため、分析対象種と蓄積壁との相互作用の可能性は無視される可能性があります。それぞれのUV-visピークの下の面積は、サンプル内の他の種がそれぞれの波長で吸収しないか、および/またはi)分別条件ii)で別の保持時間でエルトがAF4膜を介して除去されると仮定して、ビール・ランバート法を使用してAuNP質量に直接相関させることができる。</li>
		<li>直接注入と分数の実行の両方から取得した dat. ファイルをインポートします。</li>
		<li>[概要]タブで UV-vis 検出器トレースを選択します。</li>
		<li>すべての測定値の信号とベースラインビューで、対象領域(ROI)とベースラインを定義します。</li>
		<li>挿入を使用して直接射出キャリブレーションを挿入します。</li>
		<li>[直接射出 キャリブレーション設定]ビューですべての直接射出 実行を選択し、UV の消光係数を入力します。 注: キャリブレーションと分数測定の両方に同じ UV-vis の消滅係数を使用することが重要です。</li>
		<li>ROI 内の UV-vis 信号トレースの下の領域と、入力された濃度と注入量から計算された注入量を使用して、キャリブレーションラインを確立します。取得したキャリブレーションは、別の 直接注入キャリブレーション機能 ウィンドウに表示されます。</li>
		<li>キャリブレーション関数をそれぞれの分数測定に割り当てます。 注: キャリブレーションサイズ標準と未知の AuNP サンプルごとに、AuNP のサイズに依存する UV-vis 吸光度により、個別のキャリブレーション機能を確立する必要があります。このUV-vis検出器の欠点は、ICP-MSなどの質量感応検出器を用いて回避することができる。</li>
		<li>定量結果計算を挿入して分析を実行すると、結果は右のテーブル内に濃度と注入量の値として表示されます。</li>
	</ol></li>
	<li>AF4システムメーカーが提供するデータ評価ソフトウェアまたはスプレッドシート分析を使用して、製造元のマニュアルに記載されている指示に従って、それぞれのデータ取得ソフトウェアから、必要なすべての生データ(すなわち、それぞれのUV-visピークマキシマおよびそれぞれのボイド時間でのAuNPキャリブレーション基準の保持時間)を使用して、保持時間の変動を計算します。<ol>
<li>[概要]ウィンドウを開き、読み込まれたすべての計測値に対応する UV トレースを表示します。</li>
		<li>ピーク検出は自動的に実行されます。パフォーマンスを最適化するために、信号処理ツールボックス内のピーク検出パラメータを調整します。すべての測定ファイルを通過して、それぞれのピークマキシマを抽出します。</li>
		<li>次の式を使用して、すべての測定値の相対標準偏差を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg"> 計算は、それぞれのスプレッドシートソフトウェアを使用して実行することもできます。</li>
	</ol></li>
	<li>メーカーのマニュアルに記載されている指示に従って、各データ取得ソフトウェアから必要なすべての生データ(UV-visピーク最大分析対象および各ボイドタイム)をエクスポートした後、メーカーが提供するデータ評価ソフトウェアまたはスプレッドシート分析を使用して、サイズ決定を行います。外部サイズキャリブレーション機能は、以前に実行されたDLS測定から得られた流体力学的サイズに対して、AuNPサイズ標準(20nm、40nm、80 nm、100nm)のボイド時間補正保持時間(正味保持時間、 表5を参照)をプロットすることによって確立することができる( 表4参照)。 注: DLS 測定は、類似したサンプルプロパティを確保するために、それぞれの分画測定と同じ日に理想的に行う必要があります。<ol>
<li>.datファイルをインポートすると、すべての測定値が [概要 ]タブに表示されます。オーバーレイ・ウィンドウの下に表示される検出器リストから UV-vis 検出器信号を選択します。各測定値の ROI とベースラインを定義し、 信号とベースライン ビューで調整できます。右側の [信号処理 ]ツールボックスを使用して、騒がしい信号を滑らかにしてください。 処理パラメータを他の実行に割り当てる 関数を使用すると、パラメータを他の計測値にそれぞれ割り当てることができます。</li>
		<li>[挿入]タブから[パーティクル サイズの調整]を選択します。</li>
		<li>右上の「キャリブレーション用の参照を選択」テーブルでそれぞれの測定値をクリックして 、すべてのキャリブレーション 実行を選択します。選択したすべての測定値が下の表に表示されます。 表 4に指定されているすべてのキャリブレーション測定の流体力学半径を入力します。関数は、パーティクルサイズのキャリブレーション - 関数ウィンドウに表示され、式も表示されます。 注: 確立されたサイズ調整関数の相関係数 (R2)は、≥0.990 でなければなりません。</li>
		<li>[割り当て実行の選択]リスト内のそれぞれの分数を選択して、未知のAuNPサンプルの測定値にキャリブレーション機能 を割り当てます 。</li>
		<li>[挿入]タブでパーティクル サイズ分布の計算を開いて結果を表示します。以前に作成した粒子サイズのキャリブレーションは、未知のAuNPサンプル測定のキャリブレーションとしてリストされ、右のウィンドウ設定に表示されます。計算されたサイズは、最大ピークにラベル付けされたサイズ分布ウィンドウに表示されます。「サンプルの平均信号」チェックボックスを選択すると、1つのサンプルのすべての測定値を平均化し、結果をピークの最大ラベルにリスト表示します。</li>
		<li>さらに、[キャリブレーション カーブを表示 ]チェックボックスを選択して、フラクトグラム上にキャリブレーションラインをプロットします。累積サイズ分布は、[ 累積分布を表示 ]チェックボックスを選択して利用できます。 注: データ評価のために製造元のソフトウェアを使用する場合は、すべての結果をレポートに追加することをお勧めします。 [レポート] ボタンをクリックすると、すべての結果、表、および図表がドキュメントに追加されます。[レポート] タブで、[ドキュメント] セクションで[レポート設定]を開いて、レポートの設定を変更できます。</li>
	</ol></li>
</ol>

この原稿の著者は、すべてのポストノバ分析GmbHの従業員であり、その製品はこのプロトコルで利用されています。

未知のAuNPの流体力学的サイズは、20nmから100nmまでの明確に定義されたAuNPサイズ標準を使用してUV-vis検出器と組み合わせたAF4によって正確に評価されました。開発されたAF4法は、測定された保持時間とAuNPサイズとの間に線形関係を確立するために、一定のクロスフロープロファイルを用いて最適化され、線形回帰分析から簡単なサイズ決定が可能になりました。特に焦点は、分画中に有意なサンプル損失を示さない十分に高い回収率を達成すること、および適用された溶出および膜を含む開発されたAF4法が全ての分画されたAuNPサンプルとよく一致することであった。
メソッドの開発は、AF4の最も重要なステップであり、チャネル寸法、流れパラメータ、溶離性、膜、スペーサーの高さ、さらにはサンプル特性を含むいくつかのパラメータは、特定の溶出時間ウィンドウ内の分数を改善するために考慮する必要があります。この段落の目的は、ここで説明する未知の AuNP サンプルのサイズを正しく判断するために最適化された重要な手順を読者に説明することです。一般的にAF4法を開発する方法のより詳細な説明については、読者は'ISO/TS21362:2018 - ナノテクノロジー - 非対称流と遠心水流分画を用いたナノ物体の分析'25のAF4セクションに言及されている。表3に示した適用された分画条件を詳しく見ると、第1の重要なステップは、AF4チャネルにおけるAuNPサンプルの導入と緩和である。このステップは、注入流、フォーカスフローおよびクロスフローによって支配され、その相互作用はサンプルが膜表面の近くに位置し、基本的に分別の出発点を定義するAF4チャネルの注入口の近くの狭いバンドに集中させる。サンプルの十分な緩和は、このステップの間に必須であり、異なるサイズのサンプル構成成分はAF4チャネルの異なる高さに位置し、それによって正常なサイズ分別の基礎を提供する。不完全なサンプルの緩和は、通常、非保持(すなわち、非リラックス)サンプル成分に起因する増加した空隙ピーク領域によって見える。この効果は、射出時間および/または適用されるクロス流量を増加させることによって軽減することができます。しかし、両方のパラメータは、特にAF4膜上に凝集および吸着を起こしやすいサンプルに対して、慎重な最適化を必要とし、異なるパラメータ設定36,37について得られたそれぞれの回復率によって監視することができる。5分間の塗布された注入時間と1.0 mL∙min-1のクロス流量により、すべてのAuNPサンプルの回収率>80%と、ほぼ最適な緩和条件を示す無視できるボイドピーク領域が明らかになった。AuNP試料の十分な緩和後、焦点流を停止し、AF4チャネル長に沿って各UV-vis検出器に沿ってサンプル輸送を開始し、第2臨界工程を表した。妥当な分析時間で十分に高い分別力を確保するために、30〜50分間(各分画されたAuNPサイズ標準に応じて)1.0 mL∙minの一定のクロスフローレートが続き、検出器流量0.5mL.min-1で10分の線形クロスフロー減衰が適用されました。すべてのAuNPサイズ標準の分離を越えた一定のクロスフロープロファイルを用いて、FFF理論22に続く保持時間とAuNPサイズとの間の線形関係を明らかにし、単純な線形回帰分析によって未知のAuNPサンプルのサイズ決定を可能にした。しかしながら、一定のクロスフロー以外のプロファイルは、ナノ粒子のサイズ変更にも利用されており、最終的には保持時間と粒子サイズ38,39との間の非線形関係を導いている。また、明確に定義されたサイズ基準を用いたAF4におけるサイズ決定は、AuNPに限定されるものではなく、他のサイズおよび元素組成を有するナノ粒子にも適用できる(例えば、銀38、40またはシリカナノ粒子41,42)。さらに、希薄サンプルを扱う場合、ICP-MSはAF4と結合できる高感度元素検出器であり、懸濁液中の多種多様なナノ粒子のサイジングに対するこの分析アプローチの汎用性を高めます。
その広範な適用にもかかわらず、AF4の明確に定義されたサイズ標準を使用して外的なサイズの口径測定は未知のサンプルの正確なサイジングのためにそれを使用するとき考慮されるべきいくつかの特質がある。まず、それぞれのサイズ標準と実際のサンプルの分数の間に、同等の条件の適用に大きく依存します。ここで示した場合、AuNPサイズ標準と未知のAuNPサンプルの両方が同じAF4法と同じ溶出体と同じ膜を使用して分画されるため、このアプローチはかなり柔軟性がありません。さらに、サイズ感受性検出器を有しない、例えば、光散乱(MALSおよびDLS)を手元に、サイズ規格を用いたそれぞれのAF4法が十分に機能するか否かを判断することは困難である。これは特に、すべてのサンプル構成成分が通常の溶出パターンに従うかどうかは不明である未知のサンプルに当てはまります:より小さい粒子からより大きな粒子への分別、またはより大きなサンプル構成成分が既に立体ハイパーレイヤーモードで溶出している場合、より小さなサンプル構成体43,44と共溶出する可能性がある。さらに、FFF理論は、AF4が流体力学的サイズの違いに基づいて分離し、粒子が環境22と相互作用することなくポイントマスと見なされることを強調しているにもかかわらず、現実は粒子粒子と粒子膜相互作用(静電引力/反発またはファン・デル・ワールスの魅力など)とは異なる物語を伝え、潜在的に測定可能なサイズの偏差に影響を与える可能性がある。したがって、目的の粒子の組成と表面特性(ゼータ電位)に理想的に一致するサイズ基準を使用することが推奨される40,42または、これらが利用できない場合は、少なくとも十分に特徴付けられた粒子サイズ標準 (例えば、ポリスチレンラテックス粒子) を使用し、特にそれぞれの環境におけるその表面ゼータ電位の観点から、その表面の観点からは、それらの表面のゼータ電位との比較可能性を慎重に評価する必要があります。
AF4の多様性は、この分野22、48、49の他のほとんどの一般的なサイジング技術を超えたアプリケーション範囲を提供するので、しばしばその最大の強みと考えられています。同時に、その関連する推定可能な複雑さのために、特にDLS、ナノ粒子追跡分析、または単一粒子ICP-MSのような高速かつ表向きは使いやすいサイジング技術に対して最も重大な欠点とみなされるかもしれません。しかし、AF4をこれらの一般的なサイジング技術で視野に入れると、すべての技術には長所と短所がありますが、それらのすべてがナノ粒子の物理化学的性質をより包括的に理解することに貢献するため、競争力ではなく補完的なものとみなされるべきです。
ここで示す標準的な操作手順(SOP)は、サスペンション中の未知のAuNPサンプルのサイジングのための外部サイズ較正を伴うAF4-UV-visの優れた適用性を強調し、最終的にはHorizon 2020プロジェクトのフレームで行われた国際相互実験間比較(ILC)内の未知のAuNPサンプルのAF4分析のための推奨ガイドラインとして適用された、 ACEnano(このILCの結果は今後の公開予定です)。したがって、このプロトコルは、ナノ粒子の特性評価の分野におけるAF4の有望な可能性を強調するAF4方法論25、50、51、52を検証し、標準化するための励ましと継続的な国際的な取り組みに追加されます。

金ナノ粒子(AuNP)は、コロイドゴールドの形で、ナノ粒子が何であるかを理解するずっと前に、ナノ粒子が現代的で科学的な語彙に入る前に、人間の文化の一部でした。彼らのナノスケールの外観の明確な知識がなければ、中断されたAuNPは、紀元前1世紀のV-VI世紀に古代中国、アラビア、インドですでに医療やその他の目的に使用されていましたが、古代ローマ人はルビーレッドの色を利用して大英博物館2のLycurgus Cup展示で有名な陶器を汚しました。西洋の世界では、中世から現代までの何世紀にもわたって、中断されたAuNPは主にガラスおよびエナメル質(カッシウスのパープル)3 の着色剤として使用され、また様々な病気(飲料水ゴールド)、特に梅毒4を治療するために使用された。
しかし、これらの研究はすべて主に中断されたAuNPの適用に焦点を当てており、その形成、その性質、ならびにその性質を調査するための最初の合理的なアプローチを導入するのは1857年のマイケル・ファラデーまでであった。ファラデーは、これらのAuNPは非常に微細な次元を持つ必要があることをすでに認識していましたが、サイズ分布に関する明示的な情報が6,7にアクセスでき、最終的にはサイズと他のAuNP特性との相関関係を可能にしたとき、電子顕微鏡の開発が始まるまでではありませんでした。
今日では、そのかなり簡単で簡単な合成、顕著な光学特性(表面プラズモン共鳴)、良好な化学的安定性、したがって軽微な毒性、ならびに利用可能なサイズおよび表面改質の点でそれらの高い汎用性のおかげで、AuNPはナノエレクトロニクス8、診断9、癌療法10、または薬物送達部などの分野で広く応用を見つけました。明らかに、これらのアプリケーションでは、適用されたAuNPのサイズとサイズ分布の正確な知識は、最適な有効性12を確保するための基本的な前提条件であり、この重要な物理化学的パラメータを決定するための堅牢で信頼性の高いツールに対する実質的な需要があります。今日では、例えば、UV-vis分光法(UV-vis)13、動的光散乱(DLS)14または単一粒子誘導結合プラズマ質量分析(spICP-MS)15を含む懸濁液中のAuNPをサイジングできる分析技術が多数あり、フィールドフロー分質(FFF)は16,170,170,170, 16, 16,
J.カルビン・ギディングス21によって1966年に最初に概念化されたFFFは、溶出ベースの分別技術のファミリーを含み、分離は静止フェーズ22、23なしで薄いリボンのようなチャネル内で行われる。FFFでは、分離は、サンプルが通常それぞれのインライン検出器に向かって下流に運ばれ、層チャネルの流れの方向に垂直に作用する外部力場との相互作用によって誘導される。これらの関連FFF技術の中でも、非対称流場流分画(AF4)は、第2の流量(クロスフロー)が力場として作用し、最も広く用いられているサブタイプ24となっている。AF4では、チャネル底部(蓄積壁)は、同時にクロスフローが膜を通過し、余分な出口を介してチャネルを離れることができるように、サンプルを保持することができる半透視可能な限外濾過膜を装備しています。この手段によって、クロスフローは、その拡散誘導フラックス(ブラウン運動)を打ち消すことによって、蓄積壁に向かってサンプルを押し出すことができる。フィールドと拡散誘導フラックスの結果として得られる平衡で;より大きな拡散係数を示す小さなサンプル構成体はチャネル中心に近づけ、より低い拡散係数を示す大きなサンプル構成体は蓄積壁に近い位置に位置します。チャネル内部の放物線流れプロファイルにより、より小さいサンプル構成成分は、チャネル流量のより速い単層で輸送され、より大きなサンプル構成体の前に溶出する。FFF保持パラメータとストークス・アインシュタイン拡散係数式を用いて、AF4におけるサンプルの溶出時間および溶出量を、その流体力学サイズ22に直接変換することができる。ここで説明した溶出挙動は、通常、通常、AF4に対して約1〜500nm(粒子特性および分画パラメータに応じて最大2000 nm)の間の粒子サイズ範囲内で有効であるのに対し、通常、このサイズ閾値25を超えて起こる。
FFF による分離後にサイズ情報を導き出す方法は 3 つあります。FFFはモジュール式の機器であるため、多角光散乱(MALS)26、27、ダイナミック光散乱(DLS)28、29、あるいは両者の組み合わせの原理に基づいて、サイズに敏感な光散乱検出器などの複数検出器と下流に組み合わせることができ、さらに形状情報30、31を得る。しかし、FFFチャネルにおける試料の保持挙動は一般的に明確な物理力によって支配されるので、サイズは数学的アプローチ(FFF理論)を用いて計算することもできるが、ここで単純な濃度検出器(例えば、UV-vis検出器)は溶出サンプル32,33の存在を示すに十分である。
第3の選択肢として、AF4とUV-vis検出を組み合わせたサスペンション中の未知の金ナノ粒子サンプルのサイジングに20〜100nmのサイズ範囲で明確に定義されたAuNP規格を使用して、外部サイズキャリブレーション34、35の適用を報告します。この簡単な実験的なセットアップは、できるだけ多くの研究所が国際研究所間比較(ILC)に参加できるようにするために意図的に選択されました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-FIL-TEF-002</td>
			<td>Used for filtration of aqueous solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Durapore Millex</td>
			<td>Used for filtration of NovaChem100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Research Plus</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 cartridge</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>ENTRIS124I-1S</td>
			<td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN5300</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Channel Oven</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN4020</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossflow Module</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>AF2000 MF Control Module</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pipette Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>ep T.I.P.S</td>
			<td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td>
			<td>neoLab</td>
			<td>1-0199</td>
			<td>Used for eluent storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1131</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>VIA-002</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaCal Gold</td>
			<td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>VIBRAX-VXR</td>
			<td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal Computer (PC)</td>
			<td>Dell Technologies</td>
			<td>/</td>
			<td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>In accordance with respective laboratory&#8217;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Z-VIA-09150868</td>
			<td>Used for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &#8805;99 %, Blotting Grade</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>2326.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &#8805;98 %, p.a</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>6771.1</td>
			<td>Used for the preparation of the cleaning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Control and Data Acquisition</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaFFF AF2000 Software</td>
			<td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for Data Evaluation</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaAnalysis Software</td>
			<td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software Package for final Data Processing</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>Origin 2019</td>
			<td>Used for final data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Degasser</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7520</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Selector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7310</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvent Organizer</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN7140</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant Mixture</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>NovaChem100</td>
			<td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip Pump</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN1130</td>
			<td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unknown AuNP sample</td>
			<td>BBI Solutions</td>
			<td>EM.GC60</td>
			<td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis Detector</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>PN3211</td>
			<td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration Unit</td>
			<td>Postnova Analytics GmbH</td>
			<td>Eluent Filtration System</td>
			<td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Milli-Q Integral 5</td>
			<td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&#937;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

粒子サイズは、ナノ粒子の概念に関連する最も重要な物理化学的パラメータである。ナノ粒子のサイズとサイズ分布の正確な知識は、様々な用途にとって最も重要です。サイズ範囲は、ナノ粒子線量の最も「活性」成分を定義するので、また重要である。
非対称流量場流分画(AF4)は、約1~1000nmのサイズ範囲の懸濁液中の粒子のサイズを設定するための強力な技術です。AF4実験からサイズ情報を導き出す方法はいくつかあります。AF4をマルチアングル光散乱または動的光散乱の原理に基づくサイズに敏感な検出器とオンラインで結合するほか、確立された理論的アプローチ(FFF理論)を使用してサンプルのサイズを保持時間と相関させるか、または明確に定義された粒子サイズ標準(外部サイズキャリブレーション)の保持時間と比較することによって、サンプルのサイズを関連付ける可能性もあります。
ここでは、AF4による未知の金ナノ粒子サンプルのサイジングに関する標準的な操作手順(SOP)の開発と社内検証を、20~100nmの範囲の金ナノ粒子標準との外部サイズ較正を用いたUV-vis検出と組み合わせたものについて述べている。この手順では、サンプル調製、AF4機器のセットアップおよび認定、未知の金ナノ粒子サンプルのAF4法の開発と分別、および確立された外部サイズキャリブレーションとの結果の相関を含む、開発されたワークフローの詳細な説明を提供します。ここで説明したSOPは、最終的に、懸濁液中のナノ粒子状サンプルのサイジングに関するAF4の優れた堅牢性と信頼性を強調する実験室間比較研究のフレームで正常に検証されました。

まず、AuNPサイズ規格をAF4で分画し、532nmの波長でのAuNPの吸光度(AuNPの表面プラズモン共鳴)を測定するUV-visによって検出した。取得したフラクトーグラムのオーバーレイを 図 1に示します。三重測定から得られたそれぞれのUV-visピーク時の各AuNPの保持時間を 表5に示す。全保存時間の相対標準偏差は1.1%を下回り、サイズが大きくなると測定分散が減少しました。全体的に、優れた再現性が達成された。一定の分離力を適用し、溶出時間と流体力学サイズの線形関係をもたらした。外部サイズキャリブレーションラインは、指定された流体力学半径を、溶出時間(正味保持時間)のボイド時間に対してプロットして確立した。線形回帰分析の結果、1.716 nm ±の切片 a = -3.373 nm、傾斜 b = 1.209 nm∙min-1 ± 0.055 nm∙min-1を持つ線形較正関数が得られた。溶出の線形挙動は、0.9958の二乗相関係数R2 で確認した。それぞれのキャリブレーション機能は、 図2に視覚的に表示されます。
第2部は未知のAuNPサンプルの分析を扱った。サンプルの3つのアリコートは、プロトコルセクション(セクション4.2)に記載されている手順に従って調製した。3つのアリコートのそれぞれは、AuNPサイズ規格にも適用された同じAF4分画法を用いて三重化で調べた。未知のAuNPサンプルから得られた9つのAF4-UV-visフラクグラムはすべて 図3 に示されており、それぞれの評価を 表6にまとめている。それぞれの保持時間の相対標準偏差は有意に低く、0.1%から0.5%の範囲であった。AuNPサイズ標準の分画から得られた粒径較正関数を用いて、UV-visピーク最大値で未知のAuNPサンプルの保持時間と相関させ、全体平均流体力学的半径29.4nm±0.2nmを計算することができた。さらに、83.1%±1.2%の合理的な質量回収が得られたので、膜表面への粒子の有意な凝集または溶解またはかなりの吸着を示さない。 図4 は、得られた粒子径分布を、適用されたAF4法の優れた堅牢性を強調した全9つのUV-vis信号トレースを平均して示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> 図1:正規化された信号強度と一定のクロス流量(ブラックライン)を用いた4つの個別のAuNPサイズ校正基準の三重分析から得られたAF4-UV-visフラクトグラム。空隙のピークは5.9分前後でグレーでハイライト表示<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">されます</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> 図2:得られた外部サイズ較正関数は、DLS測定値のそれぞれの標準偏差(表4)および得られたAF4保持時間における分散(表5)から得られた、それぞれのピーク最大値での各々の個々のAuNPサイズ較正標準の保持時間に対して指定された流体力学的半径をプロットした後である。y = a = -3.373 nm ± 1.716 nm および b = 1.209 nm·min-1 ± 0.055 nm·min-1 の形式で標準誤差を持つ線形キャリブレーション関数を線形回帰分析から計算した。R2 =0.9958の二乗相関係数を決定し、線形関係を示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> 図 3: 未知のAuNPを示す3つのアリコートの三重測定のAF4-UV-visフラクグラム。測定時間に対する適用される一定のクロス流量は黒線として示される。約 5.9 分の空隙ピークはグレーで強調表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> 図 4: 未知のAuNPサンプルの得られた平均粒度分布(赤色)と適用された線形較正関数(点線)のオーバーレイ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">コンポーネント</td>
			<td>CAS-いいえ</td>
			<td>重量(%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">水</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-オクダデセノ酸(Z)、2,2',2'-ニトリロトリス[エタノール](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">炭酸ナトリウム</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">アルコール類、C12-14-2次、エトキシレート</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">エドタテトラナトリウム</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ポリエチレング</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">オレイン酸ナトリウム</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">炭酸水素ナトリウム</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 溶出液を調製するために使用される界面活性剤混合物の成分のリスト( 材料表も参照)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis パラメータ</td>
			<td>ユニット</td>
			<td>値</td>
		</tr>
<tr>
<td>スペーサー厚さ</td>
			<td>Μ m</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>検出器の流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>クロス流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>0 (8 分間の定数)</td>
		</tr>
<tr>
<td>フォーカス流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>遅延時間/安定化時間</td>
			<td>分</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>注入流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>移行時間</td>
			<td>分</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>射出時間</td>
			<td>分</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>溶出ステップ</td>
			<td>分</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>リンスステップタイム</td>
			<td>分</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>リンスステップ流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>注入容積</td>
			<td>Μ l</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>サンプル濃度</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>膜タイプ</td>
			<td></td>
			<td>再生セルロース</td>
		</tr>
<tr>
<td>膜分子量カットオフ</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>溶 離 液</td>
			<td></td>
			<td>0.025% (v/v) 界面活性剤混合物</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis波長</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis感度</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: AF4-UV-vis分別法パラメータの概要は、分離力を適用せずに直接注入を実行する。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AF4-UV-vis パラメータ</td>
			<td>ユニット</td>
			<td>値</td>
		</tr>
<tr>
<td>スペーサー厚さ</td>
			<td>Μ m</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>検出器の流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>クロス流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>1(60分定数、10分リニア)</td>
		</tr>
<tr>
<td>フォーカス流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>遅延時間/安定化時間</td>
			<td>分</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>注入流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>移行時間</td>
			<td>分</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>射出時間</td>
			<td>分</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>溶出ステップ</td>
			<td>分</td>
			<td>70(60分定数、10分リニア)</td>
		</tr>
<tr>
<td>リンスステップ</td>
			<td>分</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>リンスステップ流量</td>
			<td>mL 分-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>注入容積</td>
			<td>Μ l</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>サンプル濃度</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>膜タイプ</td>
			<td></td>
			<td>再生セルロース</td>
		</tr>
<tr>
<td>膜分子量カットオフ</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>溶 離 液</td>
			<td></td>
			<td>0.025% (v/v) 界面活性剤混合物</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis波長</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>UV-vis感度</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: AF4-UV-vis分別法パラメータの概要は、分離力としてクロスフローを適用して分別実行を行う。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>キャリブレーション標準</td>
			<td>キャッピング剤</td>
			<td>平均サイズ (TEM) (nm)</td>
			<td>CV (平均サイズ TEM) (%)</td>
			<td>ゼータ電位(mV)</td>
			<td>SD (ゼータ電位) (mV)</td>
			<td>流体力学半径 (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (流体力学半径) (nm)</td>
			<td>Pdi</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>クエン酸</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>クエン酸</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>クエン酸</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>クエン酸</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: 適用されたAuNP較正基準の物理化学的パラメータの概要は、キャッピング剤、TEM平均サイズ、天然懸濁液中で決定されるゼータ電位、ならびにDLS流体力学的半径、および溶出で決定される多分散度指数(PDI)を含む。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>キャリブレーション標準</td>
			<td>実行</td>
			<td>ピーク時の保持時間 (最小)</td>
			<td>ピーク時の最大保存時間 (分)</td>
			<td>平均保存期間 (分)</td>
			<td>SD (%)(正味保持時間)</td>
			<td>SD (分) (正味保持時間)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>表 5:表3に記載された方法を用いて、それぞれのAF4-UV-visフラクグラムに由来する各UV-Visピーク最大値におけるAuNP較正基準の保持時間。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>アリクォート</td>
			<td>実行</td>
			<td>保持時間ピークの最大値 (分)</td>
			<td>ピーク時の平均保持時間 (最小)</td>
			<td>ピーク時の最大保存時間 (分)</td>
			<td>SD (%)保持時間</td>
			<td>流体力学半径(nm)</td>
			<td>回復(%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>表 6: それぞれのUV-Visピーク最大での保持時間の概要、外部サイズキャリブレーションから算出された流体力学的半径(図2)およびAF4-UV-vis解析から得られた未知のAuNPサンプルの回収率。

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Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

このプロトコルは、未知の金ナノ粒子サンプルのサイズを決定するためのUV-vis検出と組み合わせた非対称流動フロー分画の使用について説明する。

懸濁液中の金ナノ粒子のサイズに対する非対称流量場流分画

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.0K ビュー.  Postnova Analytics GmbH. このプロトコルは、未知の金ナノ粒子サンプルのサイズを決定するためのUV-vis検出と組み合わせた非対称流動フロー分画の使用について説明する。

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Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

生体内イオン濃度の測定のための蛍光ナノ粒子

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

生物工学

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

回生研究ハーモニックナノ粒子

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

パラメータ化拡張期充満フォーマリズムを経由Transmitral流れの運動学的モデルベースの​​解析によるグローバル拡張期機能の定量化

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

液体中のパルスレーザアブレーションによる金属ナノ粒子の生成：ナノ粒子の抗菌特性を調べるためのツール

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Protein Kinase C-delta Inhibitor Peptide Formulation using Gold Nanoparticles

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a cell-penetrating peptide, TAT, for intracellular delivery. However, TAT has shown non-specific biological activities. Gold nanoparticles (GNPs) can be used as drug delivery carriers without recognized toxicity. Therefore, we have used a GNP/peptide hybrid to deliver PKC&#948;i. Two short peptides (P2: CAAAAE and P4: CAAAAW), at a 95:5 ratio, were used to modify the surface properties of GNP. GNPs conjugated with PKC&#948;i (GNP/PKCi) are stable in distilled water, 0.9% NaCl, and phosphate-buffered saline (PBS) containing bovine serum albumin or fetal bovine serum. Intravenous injection of GNP-PKCi was previously shown to prevent ischemia-reperfusion injury of the lung. This article outlines a protocol to formulate GNP/PKCi and assess the physiochemical properties of GNP/PKCi. We have used similar methods to formulate other peptide-based drugs with GNP. This article will hopefully draw more attention to this novel intracellular drug delivery technology and its applications in vivo.

We have previously used a gold nanoparticle peptide hybrid to intravenously deliver a synthetic peptide, protein kinase C-delta inhibitor, which reduced ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Here we show the detailed protocol of the drug formulation. Other intracellular peptides can be formulated similarly.

金ナノ粒子を用いた蛋白質キナーゼ C デルタ阻害ペプチド製剤

Protein kinase C-delta inhibitor (PKC&#948;i) is a promising drug to prevent ischemia-reperfusion-induced organ injury. It is usually conjugated to a ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...