Gostaríamos de agradecer a Shreya Shah por sua revisão e conselhos.

1. Configuração de preparação fantasma doppler(Figura 2A)
<ol><li>Conecte a bomba peristáltica, o sangue imitando o reservatório de fluidos, o amortecedor de pulso e o fantasma de fluxo Doppler com os tubos de plástico.</li>
	<li>Escolha o canal com um diâmetro de 4 mm.</li>
	<li>Programe a bomba para ejetar 720 mL/min de fluido para 0,3 s e, em seguida, ejetar 50 mL/min por 0,7 s para respectivamente imitar as fases cardíacas de sístole e diastole</li>
	<li>Execute a bomba e agite suavemente os tubos para expelir possíveis bolhas de ar. NOTA: O operador pode escolher um diâmetro diferente do canal e uma taxa de bomba diferente, mas terá que garantir que a sequência de ultrassom seja rápida o suficiente para adquirir as velocidades de fluxo mais rápidas. Eq. 3 apresentado mais tarde pode ajudar a projetar a sequência.</li>
</ol>2. Configuração do scanner de ultrassom ultrarrápido(Figura 2A)
<ol><li>Conecte o scanner de pesquisa habilitado para ultrarrápido ao computador host com o link expresso PCI.</li>
	<li>Altere o adaptador transdutor no scanner de ultrassom para combinar com o conector da sonda e conecte a sonda.</li>
	<li>Execute Matlab e ative a licença do scanner de ultrassom. NOTA: Esta seção e as seguintes presumem implicitamente o uso de um sistema Verasonics Vantage.</li>
</ol>3. Programação de sequência de ultrassom
<ol><li>Usando os scripts exemplos, projete uma sequência convencional focada no "Modo B" (ou seja, ecografia) que será usada para posicionamento do teste.<ol>
<li>Ajuste a profundidade de imagem para 50 mm.</li>
		<li>Ajuste a profundidade focal para 35 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando os scripts de exemplos, projete uma sequência de ultrassom ultrarrápida.<ol>
<li>Ajuste a profundidade de imagem para 50 mm.</li>
		<li>Programa 3 ondas de plano inclinadas a [-3,0,3] grau.</li>
		<li>Defina a frequência de repetição de pulso (PRF) para 12 kHz.</li>
		<li>Use 4 meio-ciclos para a forma de onda de ultrassom, com uma frequência central dependendo da sonda utilizada. Uma frequência central de 5,2 MHz é assumida aqui.</li>
		<li>Defina a duração total para 1 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Posicionamento da sonda e aquisição de dados
<ol><li>Aplique gel de ultrassom na lente da sonda.</li>
	<li>Coloque a sonda no fantasma e inicie a sequência de ultrassom do Modo B.</li>
	<li>Localize o canal de interesse. O fluido parece mais escuro que o tecido circundante. Coloque a sonda na visão longitudinal.</li>
	<li>Mantenha manualmente a sonda na posição de interesse.</li>
	<li>Termine a sequência do Modo B e inicie o script de aquisição de sequência ultrarrápida.</li>
</ol>5. Reconstrução de imagem(Figura 2B)
<ol><li>Uma vez que a sequência acabou, salve os dados brutos (também chamados dados de Radiofrequência, "RF").</li>
	<li>Inicie o script de reconstrução de imagem usando o software padrão do sistema de ultrassom. No final do processo, a matriz de dados de QI deve ser criada. NOTA: Os ecos de ultrassom são registrados em cada elemento da sonda e para cada emissão/recepção, então armazenados na matriz de dados RF. A reconstrução da imagem aplicou a lei de atraso adequada a cada canal e resulta na matriz chamada "QI" (Em Fase/Quadratura). A complexa matriz de QI tem três dimensões: duas para espaço (profundidade e largura de imagem) e uma para o tempo</li>
</ol>6. Filtragem dedesordem (Figura 2C)
NOTA: Para as etapas 6-7, consulte o script Matlab fornecido no Material Suplementar.
<ol><li>Remodele a matriz de QI 3D (espaço x espaço x tempo) em uma matriz 2D (espaço x tempo) Casorati, chamada IQr.</li>
	<li>Calcular a decomposição de valor singular15 de QI (Eq. 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ01v3.jpg"> Eq. 1</li>
	<li>Calcule a Matriz de Similaridade Espacial C usando os vetores espaciais singulares U, conforme descrito por Baranger et al.18 (II, D), e identifique os limites do subespacial do sangue N.</li>
	<li>Use este N de corte para filtrar os dados de QI descritos em Demene et al.15 (II,C).</li>
</ol>7. Visualização de fluxo e medições de velocidade(Figura 2C)
<ol><li>Poder computacional Doppler mapeia PD integrando o envelope do QIde dados filtradoao longo da dimensão temporal (Eq. 2). As coordenadas 3D z, x e t são, respectivamente, a profundidade, largura e dimensão temporal, nt e é o número de quadros adquiridos. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ02v5.jpg"> Eq. 2</li>
	<li>Exibir o mapa PD na escala de logaritmo. Para definir o intervalo dinâmico, calcule a DP média em uma região fora do canal e use esse valor em dB como o limite inferior da faixa dinâmica. Um alcance dinâmico típico é [-30, 0] dB.</li>
	<li>Defina uma região circular de interesse (ROI) na imagem, contendo de 1 a 30 pixels.</li>
	<li>Média do sinal de QIf sobre os pixels desse ROI, para obter um vetor de pontos de <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ03v2.jpg"> tempo nt.</li>
	<li>Calcular e exibir o espectrograma Doppler de <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ04v2.jpg"> , usando a magnitude quadrada da Curva Fourier de Curto Prazo (STFT).<ol>
<li>Coloque a janela STFT para uma janela Hann de 60 amostras.</li>
		<li>Defina a sobreposição do STFT para 90% do comprimento da janela.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobreponha a frequência central em cada ponto de tempo do espectrograma.</li>
	<li>Converta os valores de frequência f em velocidades axiais sanguíneas vz usando a fórmula Doppler (Eq. 3). c0 é a velocidade do som no médio e fTW a frequência central da forma de onda de ultrassom transmitido (aqui 5,2 MHz). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ05v4.jpg"> Eq. 3</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doppler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ueber das farbige Licht der Doppelsterne und einiger anderer Gestirne des Himmels. , (2020).</li><li>Bonnefous, O., Pesqu&#233;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+domain+formulation+of+pulse-Doppler+ultrasound+and+blood+velocity+estimation+by+cross+correlation.">Time domain formulation of pulse-Doppler ultrasound and blood velocity estimation by cross correlation.</a> Ultrasonic Imaging. 8 (2), 73-85 (2004).</li><li>Bercoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+compound+doppler+imaging:+Providing+full+blood+flow+characterization.">Ultrafast compound doppler imaging: Providing full blood flow characterization.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 58 (1), 134-147 (2011).</li><li>Evans, D. H., Jensen, J. A., Nielsen, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+colour+Doppler+imaging.">Ultrasonic colour Doppler imaging.</a> Interface Focus. 1 (4), 490-502 (2011).</li><li>Nuffer, Z., Rupasov, A., Bekal, N., Murtha, J., Bhatt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+Doppler+ultrasound+of+peripheral+arteries:+a+pictorial+review.">Spectral Doppler ultrasound of peripheral arteries: a pictorial review.</a> Clinical Imaging. 46, 91-97 (2017).</li><li>Jensen, J. A., Nikolov, S. I., Gammelmark, K. L., Pedersen, M. 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Metabolism. 34 (6), 1009-1017 (2014).</li><li>Goudot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wall+Shear+Stress+Measurement+by+Ultrafast+Vector+Flow+Imaging+for+Carotid+Stenosis.">Wall Shear Stress Measurement by Ultrafast Vector Flow Imaging for Carotid Stenosis.</a> Ultraschall in der Medizin - European Journal of Ultrasound. , (2019).</li><li>Demen&#233;, C., Mairesse, J., Baranger, J., Tanter, M., Baud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+Doppler+for+neonatal+brain+imaging.">Ultrafast Doppler for neonatal brain imaging.</a> NeuroImage. 185, 851-856 (2019).</li><li>Villemain, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+Ultrasound+Imaging+in+Pediatric+and+Adult+Cardiology.">Ultrafast Ultrasound Imaging in Pediatric and Adult Cardiology.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. , (2019).</li><li>Provost, J., Papadacci, C., Demene, C., Gennisson, J. L., Tanter, M., Pernot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrafast+doppler+imaging+applied+to+the+noninvasive+mapping+of+blood+vessels+in+Vivo.">3-D ultrafast doppler imaging applied to the noninvasive mapping of blood vessels in Vivo.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 62 (8), 1467-1472 (2015).</li><li>Osmanski, B. F., Montaldo, G., Fink, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+out-of-plane+Doppler+imaging+based+on+ultrafast+plane+wave+imaging.">In vivo out-of-plane Doppler imaging based on ultrafast plane wave imaging.</a> IEEE International Ultrasonics Symposium, IUS. 62 (4), 76-79 (2013).</li><li>Kim, M. W., Zhu, Y., Hedhli, J., Dobrucki, L. W., Insana, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+Clutter+Filter+Optimization+for+Ultrasonic+Perfusion+Imaging.">Multi-dimensional Clutter Filter Optimization for Ultrasonic Perfusion Imaging.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 65 (11), 2020-2029 (2018).</li><li>Chau, G., Li, Y. L., Jakovljevic, M., Dahl, J., Rodr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Wall Clutter Removal in Doppler Ultrasound using Principal Component Pursuit. , (2018).</li><li>Tierney, J., Baker, J., Brown, D., Wilkes, D., Byram, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Component-Based+Spatiotemporal+Clutter+Filtering+for+Slow+Flow+Ultrasound.">Independent Component-Based Spatiotemporal Clutter Filtering for Slow Flow Ultrasound.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. , 1-1 (2019).</li><li>Zhang, N., Rivaz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clutter+Suppression+in+Ultrasound:+Performance+Evaluation+and+Review+of+Low-Rank+and+Sparse+Matrix+Decomposition+Methods.">Clutter Suppression in Ultrasound: Performance Evaluation and Review of Low-Rank and Sparse Matrix Decomposition Methods.</a> BioMedical Engineering Online. 19, 37 (2020).</li><li>Guidi, G., Licciardello, C., Falteri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+spectral+broadening+(ISB)+in+ultrasound+Doppler+as+a+combination+of+transit+time+and+local+geometrical+broadening.">Intrinsic spectral broadening (ISB) in ultrasound Doppler as a combination of transit time and local geometrical broadening.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 26 (5), 853-862 (2000).</li><li>Cloutier, G., Shung, K. K., Durand, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+Evaluation+of+Intrinsic+and+Nonstationary+Ultrasonic+Doppler+Spectral+Broadening+in+Steady+and+Pulsatile+Flow+Loop+Models.">Experimental Evaluation of Intrinsic and Nonstationary Ultrasonic Doppler Spectral Broadening in Steady and Pulsatile Flow Loop Models.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 40 (6), 786-795 (1993).</li><li>Winkler, A. J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+intrinsic+spectral+broadening+errors+in+doppler+peak+velocity+measurements+made+with+phased+sector+and+linear+array+transducers.">Correction of intrinsic spectral broadening errors in doppler peak velocity measurements made with phased sector and linear array transducers.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 21 (8), 1029-1035 (1995).</li><li>Osmanski, B. F., Bercoff, J., Montaldo, G., Loupas, T., Fink, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancellation+of+Doppler+intrinsic+spectral+broadening+using+ultrafast+Doppler+imaging.">Cancellation of Doppler intrinsic spectral broadening using ultrafast Doppler imaging.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (8), 1396-1408 (2014).</li><li>Sauvage, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+aperture+row+column+addressed+probe+for+in+vivo+4D+ultrafast+doppler+ultrasound+imaging.">A large aperture row column addressed probe for in vivo 4D ultrafast doppler ultrasound imaging.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (21), (2018).</li><li>Correia, M., Provost, J., Tanter, M., Pernot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+ultrafast+ultrasound+flow+imaging:+in+vivo+quantification+of+arterial+volumetric+flow+rate+in+a+single+heartbeat.">4D ultrafast ultrasound flow imaging: in vivo quantification of arterial volumetric flow rate in a single heartbeat.</a> Physics in Medicine and Biology. 61 (23), 48-61 (2016).</li><li>Center for Devices and Radiological Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+Information+for+Manufacturers+Seeking+Marketing+Clearance+of+Diagnostic+Ultrasound+Systems+and+Transducers.">FDA Information for Manufacturers Seeking Marketing Clearance of Diagnostic Ultrasound Systems and Transducers.</a> Center for Devices and Radiological Health. , (2008).</li><li>I, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IEC+62127-1+-+Measurement+and+characterization+of+medical+ultrasonic+fields+up+to+40+MHz.">IEC 62127-1 - Measurement and characterization of medical ultrasonic fields up to 40 MHz.</a> IEC. , 61010-61011 (2013).</li></ol>

Nenhum conflito de interesses

Várias variações são possíveis em torno do quadro principal deste protocolo.
Preocupações com hardware Se o usuário fornece seu computador host personalizado, a placa-mãe e a caixa do computador devem ter um slot expresso PCI disponível. A CPU também deve ter pistas PCIe suficientes para lidar com todos os dispositivos.
Seleção de sondas A sonda de ultrassom (também chamada transdutor) é escolhida de acordo com ...

A imagem de ultrassom é uma das técnicas de imagem mais utilizadas em atividades clínicas e de pesquisa. A combinação de emissão de ondas de ultrassom nos tecidos biológicos seguida pelo registro dos ecos backscattered permite a reconstrução de imagens anatômicas, o chamado "Modo B". Este método é perfeitamente adaptado para imagens de tecidos moles, como tecidos biológicos, que normalmente permitem a penetração de ultrassom ao longo de vários centímetros, com uma velocidade de propagação de ≈ 1540 m/s. Dependendo da frequência central da sonda de ultrassom, são obtidas imagens com resolução de 30 μm a 1 mm. Além disso, é sabido que o movimento de uma fonte acústica afeta as características físicas das ondas associadas. Particularmente, a ligação entre as mudanças de frequência de uma onda em relação à velocidade de sua fonte é descrita como o efeito Doppler1, cuja manifestação mais simples é o tom da sirene em movimento de uma ambulância em movimento. A imagem de ultrassom há muito usa esse efeito físico para observar os glóbulos vermelhos em movimento2, e propõe uma variedade de modos de imagem comumente rotulados como "Imagem doppler". Esses modos permitem a avaliação dos fluxos sanguíneos em aplicações e órgãos muito diferentes, como cérebro, coração, rim ou artérias periféricas.
Notavelmente, a maioria dos sistemas de ultrassom atualmente disponíveis dependem da mesma tecnologia, referida como ultrassom convencional. Os princípios subjacentes são os seguintes: um feixe acústico insoniza o campo de visão e é varrido ao longo da abertura do transdutor de ultrassom. Para cada posição do feixe, os ecos são gravados e convertidos em uma linha da imagem final. Ao mover progressivamente o feixe ao longo do transdutor, todo o campo de visão pode ser imageado linha por linha(Figura 1, painel esquerdo). Essa estratégia foi bem adaptada às restrições elétricas e ao poder computacional vigente até o início do século XXI. No entanto, tem várias desvantagens. Entre elas, a taxa de quadros final é limitada a algumas centenas de imagens por segundo pelo processo de varredura do feixe. Em termos de fluxo sanguíneo, essa taxa de quadro relativamente baixa afeta as velocidades máximas de fluxo que podem ser detectadas, o que é ditado pelos critérios amostrais de Shannon-Nyquist3. Além disso, o Doppler convencional deve lidar com uma negociação complexa. Para avaliar a velocidade do fluxo sanguíneo em uma determinada região de interesse (ROI), vários ecos provenientes desse ROI devem ser sucessivamente registrados. Isso implica que o feixe de ultrassom é temporariamente mantido em posição fixa. Quanto mais tempo o conjunto de eco, melhor será a estimativa de velocidade para esse ROI. No entanto, para produzir uma imagem completa do campo de visão, o feixe deve escanear o meio. Portanto, pode-se sentir o conflito entre essas duas restrições: segurar o feixe para avaliar precisamente a velocidade ao longo de uma linha, ou mover o feixe para produzir uma imagem. Os diferentes modos convencionais do Doppler (ou seja, Color Doppler ou Pulse Wave Doppler) refletem diretamente essa troca. Normalmente, o Color Doppler produz um mapa de fluxo de baixa fidelidade usado para localizar os vasos4, e o Doppler de onda de pulso é então usado para quantificar com precisão o fluxo em um vaso5previamente identificado .
Essas duas limitações (baixa taxa de quadros e tradeoff de localização/quantificação) são superadas com técnicas emergentes de alta estruturação. Entre elas, a abordagem de abertura sintética6 ou a técnica de transmissão multiline podem sercitadas 7. Neste estudo, focamos no chamado método ultrarrápido ultrarrápido. Introduzido há duas décadas8,9,10, este método também conta com a emissão/recepção de ultrassons, mas com um padrão radicalmente diferente. De fato, em vez de usar um feixe focado em varredura, a imagem ultrarrápida usa ondas de plano ou ondas divergentes, que são capazes de insonificar o campo de visão com uma única emissão. Após essa única emissão, a eletrônica associada também é capaz de receber e processar o enorme número de ecos originários de todo o campo de visão. No final, uma imagem pode ser reconstruída a partir de um único padrão de emissão/recepção11 (Figura 1, painel direito). Essas emissões desfocadas podem ter uma baixa relação sinal/ruído (SNR) devido à disseminação da energia acústica. Isso pode ser abordado emitindo várias ondas de plano intituladas (ou ondas divergentes com diferentes fontes) e adicionando as imagens resultantes. Este método é chamado de "composição coerente"12. Duas grandes consequências surgem. Em primeiro lugar, a taxa de quadros depende apenas do tempo de ultrassom do voo e pode atingir valores típicos de 1 a 10 kHz. Em segundo lugar, isso garante a continuidade dos dados tanto nas dimensões espacial quanto temporal, também referida como coerência espacial. A troca convencional de localização/quantificação está, portanto, quebrada. Essa combinação de alta framerate e coerência espostetemporal tem um tremendo impacto na capacidade de detectar fluxos sanguíneos com ultrassom. Em comparação com o ultrassom convencional, o ultrassom ultrarrápido proporciona caracterização completa do fluxo sanguíneo3. Na prática, o usuário tem acesso ao curso de tempo de velocidade em cada pixel da imagem, durante toda a duração da aquisição (tipicamente ≈1 s), com uma escala de tempo dada pelo framerate (tipicamente, uma taxa de quadros de 5 kHz para uma resolução temporal de 200 μs). Esta alta taxa de quadros torna o método adequado para uma ampla gama de aplicações, como fluxo rápido em órgãos móveis como câmaras cardíacas13 ou miocárdio com a micro-perfusão coronariana14. Além disso, mostrou-se que sua coerência espostetemporal melhora fortemente sua capacidade de separar o fluxo sanguíneo lento dos tecidos móveis de fundo, aumentando assim a sensibilidade ao fluxo micro-vascular15. Essa capacidade dá acesso à micro vasculatura do cérebro em ambos os animais16 e humanos17.
Portanto, o ultrassom ultrarrápido é adequado para o fluxo sanguíneo da imagem em uma variedade de situações. É restrito a tecidos biológicos moles e será fortemente afetado pela presença de interfaces duras, como ossos, ou cavidade gasosa, como o pulmão. A sintonia dos parâmetros físicos da sequência de ultrassom permite o estudo tanto de fluxos lentos (até 1 mm/s11,16) quanto de fluxos rápidos (até vários m/s). Existe uma troca entre a resolução espacial e a profundidade da penetração. Normalmente, uma resolução de 50 μm pode ser alcançada ao custo de uma penetração em torno de 5 mm. Por outro lado, a penetração pode ser estendida para 15-20 cm ao custo de uma resolução de 1 mm. Vale ressaltar que a maioria dos scanners ultrarrápidos como o usado neste artigo apenas fornecem imagens 2D.
Aqui, propomos um protocolo simples para introduzir o conceito de imagem Ultrafast Doppler, usando um scanner de ultrassom de pesquisa programável e doppler fantasma imitando um vaso (artéria ou veia) embutido no tecido biológico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood-mimicking fluid</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>069DTF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doppler flow phantom</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>ATS523A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks, Natick, Massachusetts, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump / Doppler flow pump</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>769</td>
			<td>Include tubings and pulse dampener</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer adpter</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>UTA 408-GE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast ultrasound research scanner</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>Vantage 256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound probe/transducer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE 9L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blood flow imaging with ultrafast doppler

O efeito Pulsed-Doppler é a principal técnica usada na echografia clínica para avaliar o fluxo sanguíneo. Aplicado com modos de ultrassom convencional focado do doppler, ele tem vários limites. Em primeiro lugar, uma operação de filtragem de sinal finamente ajustada é necessária para distinguir os fluxos sanguíneos dos tecidos móveis circundantes. Em segundo lugar, o operador deve escolher entre localizar os fluxos sanguíneos ou quantificá-los. Nas últimas duas décadas, a imagem de ultrassom sofreu uma mudança de paradigma com o surgimento do ultrassom ultrarrápido usando ondas desfocadas. Além de um aumento de cem vezes na taxa de quadros (até 10000 Hz), esta nova técnica também quebra a troca convencional de quantificação/localização, oferecendo um mapeamento completo do fluxo sanguíneo do campo de visão e um acesso simultâneo a medidas de velocidade finas no nível de pixel único (até 50 μm). Essa continuidade de dados em dimensões espaciais e temporais melhora fortemente o processo de filtragem de tecido/sangue, o que resulta em uma sensibilidade maior a pequenas velocidades de fluxo sanguíneo (até 1 mm/s). Neste artigo de método, pretendemos introduzir o conceito de Doppler ultrarrápido, bem como seus principais parâmetros. Em primeiro lugar, resumimos os princípios físicos da imagem de ondas desfocadas. Em seguida, apresentamos os principais passos principais de processamento de sinal Doppler. Particularmente, explicamos a implementação prática dos algoritmos críticos de separação de tecido/fluxo sanguíneo e sobre a extração de velocidades desses dados filtrados. Esta descrição teórica é complementada por experiências in vitro. Um fantasma de tecido incorporando um canal com fluido de imitação de sangue fluindo é imageado com um sistema de ultrassom programável de pesquisa. Uma imagem de fluxo sanguíneo é obtida e as características de fluxo são exibidas para vários pixels no canal. Por fim, propõe-se uma revisão das aplicações in vivo, mostrando exemplos em diversos órgãos como carótidas, rim, tireoide, cérebro e coração.

A qualidade da aquisição e do pós-processamento é avaliada em primeiro lugar pela inspeção visual. A forma do canal deve ser claramente visível na imagem doppler de poder, e a área do tecido deve parecer escura. Se o sinal do Doppler de potência não estiver restrito ao canal, pode significar que ou o passo do filtro de desordem deu errado (o limiar SVD é muito baixo), ou a sonda experimentou um forte movimento durante a aquisição.
Após inspeção visual, o estudo do espectrograma...

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Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Este protocolo mostra como aplicar imagens do Doppler ultrarrápida para quantificar os fluxos sanguíneos. Após uma longa aquisição de 1 s, o experimentador tem acesso a um filme do campo de visão completo com valores de velocidade axiais para cada pixel a cada pixel a cada pixel ≈0,3 ms (dependendo do tempo de ultrassom do voo).

Imagem de fluxo sanguíneo com Doppler Ultrarrápido

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

blood-flow-imaging-with-ultrafast-doppler

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Electrical Engineering

Anatomy and Physiology

Bioengineering

Unit 1

Sampling

Blood Vessels and Circulation

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K visualizações.  The Hospital for Sick Children, PGCRL Research Institute. Este protocolo mostra como aplicar imagens do Doppler ultrarrápida para quantificar os fluxos sanguíneos. Após uma longa aquisição de 1 s, o experimentador tem acesso a um filme do campo de visão completo com valores de velocidade axiais para cada pixel a cada pixel a cada pixel ≈0,3 ms (dependendo do tempo de ultrassom do voo).

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Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Bioengenharia

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Detecção sensível de Proteopathic Sementeira Atividade com FRET Citometria de Fluxo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

In Vitro Modelo de fisiológicos e patológicos fluxo de sangue com aplicativos para Investigações de Reformas celular Vascular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a key hemodynamic parameter related to cerebral oxygen supply. Resting state low frequency fluctuations based on oxygenation contrast have been shown to provide correlations between functionally connected regions. The presented protocol uses optical diffuse correlation spectroscopy (DCS) to assess blood flow-based resting state functional connectivity (RSFC) in the human brain. Results of CBF-based RSFC in human frontal cortex indicate that intra-regional RSFC is significantly higher in the left and right cortices compared to inter-regional RSFC in both cortices. This protocol should be of interest to researchers who employ multi-modal imaging techniques to study human brain function, especially in the pediatric population.

This protocol demonstrates how to measure resting state functional connectivity in the human prefrontal cortex using a custom-made diffuse correlation spectroscopy instrument. The report also discuss practical aspects of the experiment as well as detailed steps for analyzing the data.

Conectividade funcional do estado de repouso do cérebro humano por meio de espectroscopia de correlação difusa óptica

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caracterizando mudanças conformais de molécula única fluxo de cisalhamento com microscopia de fluorescência

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantificando a organização do colágeno fibrilar com ferramentas baseadas em curvas

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...