Quantificar as alterações conformais em biomoléculas únicas sob fluxo de cisalhamento é útil para entender a função e a biofísica de macromoléculas como proteína e DNA. A microscopia de fluorescência permite a visualização em tempo real in situ de moléculas únicas em ambientes de fluxo fisiológico com alta resolução temporal e espacial. Isso é incomparável por outras técnicas como a AFM.
Ao caracterizar a força de tesoura sob a qual as proteínas do nosso DNA têm alterações conformais globais, pode-se projetar melhor drogas que imitam essas propriedades biofísicas. Este protocolo pode ser amplamente aplicado para estudar o comportamento ou outros polímeros, especialmente os biopolímeros, em diferentes condições de fluxo e para investigar a reologia de fluidos complexos. O timing das etapas é fundamental para o sucesso.
Sugerimos a prática do tratamento de superfície do dispositivo microfluido e passos de microscopia de fluorescência muitas vezes para executá-los de forma eficiente. Capturar mudanças conformais em biomoléculas é um fenômeno visual e dinâmico melhor visto no filme. Os cientistas entenderão melhor esse método depois de ver a microscopia de proteína e DNA em tempo real apresentada neste vídeo.
Para preparar o dispositivo microfluido, adicione cinco partes da base de elastômero de silicone a uma parte do agente de cura em um barco de pesagem. e mexa o conteúdo completamente por um minuto para criar uma solução PDMS pré-curada. Coloque o wafer de silício mestre em uma placa de Petri de plástico e despeje a solução PDMS sobre o wafer para criar uma camada de cinco milímetros.
Cubra o prato e deixe-o em um desiccador sob vácuo por uma hora para remover bolhas de ar. Em seguida, incubar a placa de Petri coberta a 60 graus Celsius durante a noite para curar o PDMS em um sólido flexível, o que resultará em canais microfluidos sendo moldados no PDMS na interface do wafer PDMS. No dia seguinte, use uma navalha para cortar retângulos de 20 por 10 milímetros em torno de cada canal microfluido no PDMS e remova os blocos retangulares com pinças.
Use uma agulha de extremidade sem medida de 25 bitolas com bordas afiadas para perfurar um buraco de 0,5 milímetros de diâmetro em uma extremidade do canal, certificando-se de que o orifício passe completamente pelo bloco PDMS. Use uma agulha fina para socar o PDMS para fora do orifício e repetir o processo na outra extremidade do canal. Coloque o bloco PDMS com o lado do canal para cima e a tampa na câmara de uma máquina de ligação plasmática e inicie o tratamento.
Quando o tratamento estiver concluído, coloque rapidamente o bloco PDMS em uma tampa para que o canal esteja em contato com o deslizamento. Aplique pressão nas bordas do bloco e coloque o conjunto PDMS em uma placa quente a 115 graus Celsius por 15 minutos para reforçar o vínculo permanente. Por fim, insira um comprimento de 10 centímetros.
Tubo de diâmetro interno de 0,25 milímetros no orifício de saída na parte superior do bloco PDMS para permitir que o fluido flua facilmente para fora do canal. Para o fator von Willebrand ou experimentos VWF injetar até 10 microlitres de 10 microgramas por mililitro BSA-Biotin dissolvido em PBS 1X estéril na entrada do dispositivo microfluido. Retenha alguns microliters de BSA-Biotin na ponta da pipeta após a injeção e deixe que a ponta permaneça embutida na entrada.
Permita que o BSA-Biotin incubar no dispositivo por duas horas, o que resultará em BSA não especificamente ligado à superfície do deslizamento de tampas. Em seguida, remova a ponta da pipeta e injete até 10 microliters de solução de bloqueio de caseína no canal. Permita que a solução casein incubar por 30 minutos para que possa bloquear quaisquer locais livres e reduzir a ligação inespecífica das biomoléculas à superfície.
Remova a ponta e injete até 10 microliters de streptavidina em PBS estéril no canal, que se ligará aos grupos de biotina do BSA-Biotin. Em seguida, injete até 10 microliters de solução detergente para lavar o excesso de streptavidina. Remova a ponta e injete vwf em solução de caseína ou DNA lambda.
Incubar VWF por três minutos ou DNA lambda por 45 minutos. Em seguida, injete cinco biotinas livres de milimólar para bloquear o excesso de energia. Carregue um mililitro da solução de bloqueio de caixa em uma seringa e fixe-a em uma bomba de seringa.
Em seguida, conecte uma extremidade da tubulação à agulha da seringa e flua na solução para remover bolhas de ar. Aproximadamente três minutos após a injeção de biotina gratuita anexar a outra extremidade do tubo à entrada do dispositivo microfluido. Selecione o objetivo de ampliação mais alto do TIRF ou microscópio de fluorescência confocal.
Se necessário, adicione uma gota de óleo de imersão no objetivo. Coloque o dispositivo microfluido no estágio do microscópio para que o deslizamento esteja alinhado com o objetivo. Inicie a microscopia de campo brilhante e ajuste o foco para que características como detritos e bolhas sejam visíveis.
Em seguida, ajuste o estágio nas direções X e Y até que a borda do canal microfluido seja visível e bissecte o quadro. Mude para o canal FITC e ajuste o nível Z e o ângulo TIRF conforme necessário até que as moléculas globulares verdes individuais possam ser distinguidas. Ajuste a intensidade do laser e o tempo de exposição para visualizar moléculas fluorescentes sem fotografá-las muito rapidamente.
Em seguida, ajuste o contraste para melhor visualizar as moléculas. Exatamente cinco minutos após o início livre da injeção de biotina e o fluxo de parada da bomba de seringa para observar as mudanças na conformação molecular usando taxas de fluxo entre 5000 e 30.000 microliters por hora. Com o VWF é fundamental aplicar pelo menos uma pequena quantidade de fluxo, como 30 segundos de 10.000 microliter por hora, exatamente cinco minutos após a injeção gratuita de biotina.
Repita isso em várias áreas do dispositivo microfluido e localize moléculas que podem se estender e relaxar em vários ciclos de fluxo de partida e parada. Observe quanto tempo leva para as moléculas atingirem a extensão máxima e completarem o relaxamento e gravar vídeos do comportamento contínuo das moléculas sob fluxo de cisalhamento. A flexibilidade de uma molécula para alterar a confirmação é frequentemente demonstrada por sua capacidade de alongar à medida que taxas mais altas de cisalhamento são aplicadas devido ao aumento do fluxo.
A curva de extensão versus taxa de corte de uma molécula fator von Willebrand é útil para caracterizar as propriedades biomecânicas da proteína. Imagens de microscopia de fluorescência do DNA lambda também mostram aumento da extensão sobre taxas de cisalhamento mais altas em 30 segundos e relaxamento gradual ao longo de dois minutos após o fluxo ser interrompido. Ao trabalhar com VWF, lembre-se de incuba-lo apenas por três minutos e biotina livre por cinco minutos antes de iniciar o fluxo.
Isso é fundamental para formar o número ideal ou ligações biotina-streptavidina necessárias para desvendar reversíveis. Este método pode ser adaptado para visualizar interações em tempo real entre múltiplas biomoléculas e caracterizar suas funções. Por exemplo, pode-se entender melhor a formação de plugue de plaquetas visualizando o VWF desvendando sob cisalhamento alto e sua ligação com a molécula de adesão plaqueta GPIb-alfa com este método.
