Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório Coller pela contribuição útil. H.A.C. foi o bolsista Milton E. Cassel da Fundação Rita Allen. Agradecemos ao NIH/NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, ao Prêmio de Ciência da Equipe da Aliança de Pesquisa de Melanoma, ao Prêmio do Programa de Integração de Laboratório Clínico do Instituto de Pesquisa do Câncer, ao Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, ao Comitê Coordenador de Pesquisa do Câncer da Universidade da Califórnia, ao Prêmio Temático de Metabolismo da David Geffen School of Medicine, ao Clinical Translational Science Institute e ao Jonsson Comprehensive Cancer Center, Prêmios de Inovação do Centro de Pesquisa de Células-Tronco Amplas (Rose Hills e Ha Gaba), um Prêmio da UCLA SPORE em Câncer de Próstata (Instituto Nacional do Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Número de Prêmio P50CA092131), um Prêmio de Inovação do Centro de Células-Tronco Amplas, do Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research da UCLA, o Programa de Treinamento em Biologia Celular Tumoral (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), o Programa de Dermatologia T32 na UCLA AR071307 e o Programa de Treinamento em Biologia Celular Muscular, Fisiopatologia e Terapêutica T32 da UCLA 5 T32 AF 65972.

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade da Califórnia, Los Angeles.
NOTA: Selecione células cancerosas e fibroblastos que correspondam aos camundongos hospedeiros para a cepa de camundongo. Selecione células cancerosas e fibroblastos que correspondam ao sexo do camundongo hospedeiro. Obter ratos de colônias de reprodução ou comprá-los de fornecedores respeitáveis. Introduzir tumores em ratos que são ~8-10 semanas de idade. Camundongos com pelo estarão na fase telógena ou de repouso do ciclo do folículo piloso. Planeje uma proporção de 0,5 a 3 fibroblastos para célula cancerosa.
1. Determinar o número adequado de ratinhos a utilizar para a experimentação
<ol><li>Antes de realizar os estudos, realize uma análise de poder para determinar o número apropriado de camundongos a serem usados para os estudos. Use a seguinte fórmula para determinar o tamanho da amostra para um experimento com a potência especificada: n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2 Se α é o nível de significância selecionado (geralmente 0,05), então 1-α/2 = 0,975 e Z=1,960. β é a potência e se 80% de potência é desejada, então Z=0,84. ES, o tamanho do efeito = \μ1-μ 0\/σ onde μ 0 é a média da hipótese H0, μ 1 é a média da hipótese H1 e σ é o desvio padrão do desfecho de interesse22. NOTA: Mais informações sobre o cálculo do tamanho da amostra podem ser encontradas22.</li>
</ol>2. Gerar células cancerosas para injeção
<ol><li>Determine a taxa de crescimento relevante com a seguinte equação: Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t Observação : um exemplo para células que dobram em 24 horas é mostrado Tempo de duplicação = ln(2)/taxa de crescimento 24 horas = ln(2)/taxa de crescimento 24*taxa de crescimento = .693 Taxa de crescimento = .693/24= .028875</li>
	<li>Determine o número de células cancerosas para placa e a quantidade de tempo que as células precisam ser cultivadas antes da injeção. NOTA: 0,25-1 milhão de células cancerosas são injetadas para cada tumor formado.</li>
	<li>Calcular o número de dias necessários para gerar um número suficiente de células de acordo com a equação N(t)=N(0)egr*t onde N(t) é o número de células no tempo t, N(0) é o número de células no tempo 0, gr é a taxa de crescimento e t é o tempo. NOTA: Um exemplo desses cálculos para o crescimento de 500.000 células para gerar 106 células em cada um dos 12 tumores. Com base nesses cálculos, 5 dias são suficientes para crescer o número necessário de células: N(t)=N(0)egr*t 12 x 106 = 500.000e(gr*t) 12 x 106=500.000e(.028875*t) 24=e(.028875*x) ln(24)=0,028875x 3,178 = 0,028875x X=110 horas= 4,59 dias Dê tempo extra para que as células se fixem à placa e para as células que são perdidas durante a coleta.</li>
	<li>Células cancerosas de placa. NOTA: Use luvas e jalecos ao trabalhar com células cultivadas. NOTA: Realizar manipulações celulares em uma capela de fluxo laminar para minimizar a introdução de micróbios do ar nas amostras. Trate a capa de cultura de tecidos com luz ultravioleta antes de usar. Use técnica estéril e apenas plásticos e consumíveis de cultura celular estéril, como placas, pipetas e tubos cônicos tratados com cultura de tecidos.<ol><li>Calcular o número e o tamanho corretos das placas de cultura de tecidos com base no número de células no frasco para injetáveis e na concentração celular desejada uma vez plaqueadas.</li>
		<li>Rotular placas de cultura de tecidos.</li>
		<li>Prepare um banho-maria com água a 37 °C.</li>
		<li>Alíquota média em tubos cônicos e colocar em banho-maria a 37 °C. Muitas células cancerosas podem ser cultivadas no meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).</li>
		<li>Remova o número necessário de frascos para injetáveis de células congeladas do congelador de azoto líquido. NOTA: Use luvas de freezer ao manusear células em um freezer de nitrogênio líquido.</li>
		<li>Descongele rapidamente os frascos para injetáveis de células no banho-maria enquanto agita suavemente. NOTA: Adicione etanol às luvas durante o manuseio dos frascos para manter a esterilidade.</li>
		<li>Usando técnica estéril em uma capela de cultura de tecidos, pipetar as células em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de DMEM + 10% FBS.</li>
		<li>Centrifugar a mistura celular a 180 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Remova suavemente o sobrenadante com sucção estéril ou uma pipeta estéril de 10 mL.</li>
		<li>Ressuspenda suavemente as células no pellet em 1 mL de DMEM + 10% FBS.</li>
		<li>Pipetar as células ressuspensas em uma placa de cultura de tecidos marcada com uma p1000 estéril.</li>
		<li>Usando pipetas estéreis de 10 mL, meio pipeta com soro em placas de cultura de tecidos.</li>
		<li>Incubar placas de cultura de tecidos em incubadora de cultura de tecidos a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Expandir células cancerosas para gerar células cancerosas suficientes para injeção. NOTA: Monitorar células com microscopia de luz para confluência. Tripsinizar a cada dois ou três dias ou conforme necessário para evitar que as células atinjam 100% de confluência. Se for necessário um grande número de células, use hiperfrascos (Tabela de Materiais) para cultivar um grande número de células de forma eficiente em termos de espaço e meio. Cada vez que as células precisam ser passadas, siga este procedimento:<ol><li>Retire o meio da placa com sucção estéril ou uma pipeta estéril de 10 mL.</li>
		<li>Lave suavemente a placa pipetando em solução salina tamponada com fosfato (PBS) quente. Em seguida, remova o PBS com sucção estéril ou uma pipeta.</li>
		<li>Pipetar 5 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) 1x em PBS para uma placa de 10 cm sobre as células e incubar por 5 minutos a 37 °C.</li>
		<li>Remova as células da placa com torneiras suaves para desalojar as células da placa.</li>
		<li>Usando uma pipeta estéril de 10 mL, colete as células em DMEM com soro FBS a 10% em tubos cônicos.</li>
		<li>Centrifugar tubos cônicos a 180 x g por 5 minutos.</li>
		<li>Retire o sobrenadante despejando-o. A pastilha de células deve estar visível. Observe-o para se certificar de que permanece no tubo.</li>
		<li>Ressuspender as células peletizadas adicionando 1 mL de DMEM + 10% FBS e pipetando para cima e para baixo suavemente.</li>
		<li>Alíquota ressuspendeu células em novas placas de cultura de tecidos de tamanho apropriado com DMEM + 10% FBS (10 mL de meio é adequado para uma placa de cultura de tecidos de 10 cm).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Gerar fibroblastos para injeção
NOTA: Os fibroblastos primários senescem após muitas duplicações/passagens. É importante usar fibroblastos primários após um número limitado de passagens ou duplicações. Acompanhe o número de passagens ou duplicações que os fibroblastos cresceram a partir da pele do rato ou humana. Use fibroblastos com menos de 15 passagens para fibroblastos dérmicos humanos primários. Use fibroblastos com menos de 9 passagens para fibroblastos embrionários de camundongos. Os fibroblastos são alterados quando se tornam confluentes. Tripsinizar os fibroblastos quando estes forem aproximadamente 90% confluentes. Os fibroblastos terão propriedades diferentes dependendo de como são cultivados. Muitos cientistas promovem o cultivo em substratos fisiologicamente mais relevantes do que placas de cultura de tecidos, como matrizes de colágeno 3D, que capturam de forma mais eficaz ambientes semelhantes a tecidos23,24,25.
<ol><li>Use a equação da seção 2.1 para determinar a taxa de crescimento das células de fibroblastos.</li>
	<li>Use a equação da seção 2.2 para determinar o número de dias necessários para expandir os fibroblastos.</li>
	<li>Plaquear os fibroblastos conforme descrito na secção 2.3 utilizando o meio adequado no dia apropriado para garantir que as células cancerígenas e os fibroblastos estarão prontos para injeção no mesmo dia.</li>
	<li>Expandir os fibroblastos no meio apropriado para gerar um número suficiente de fibroblastos necessários após os procedimentos descritos na secção 2.4.</li>
</ol>4. Raspe ratos para preparar ratos para injeção
NOTA: Use jalecos, redes de cabelo, capas de sapatos e luvas ao trabalhar com ratos.
<ol><li>Um a dois dias antes da injeção, de acordo com as normas do Comitê Institucional de Cuidados com Animais, anestesiar os camundongos. Se estiver usando isoflurano para anestesia, use uma mistura de isoflurano e O2. Coloque os camundongos em uma câmara de anestesia e introduza uma mistura de isoflurano (5%)/ O2 para induzir a anestesia. Em seguida, colocar o cone nasal sobre o animal anestesiado para manter o plano cirúrgico da anestesia com fluxo constante da mistura isoflurano (2%)/O2 .</li>
	<li>Verifique se os animais estão no plano cirúrgico adequado da anestesia, apertando o dedo do mouse e confirmando que o mouse não se move.</li>
	<li>Usando um cortador de animais com lâmina cirúrgica #40, remova suavemente o pelo das posições apropriadas nos flancos dos camundongos, passando o cortador de animais sobre a pele várias vezes até que o pelo seja removido.</li>
	<li>Monitore os camundongos até que eles se recuperem da anestesia.</li>
</ol>5. Preparar células cancerosas e fibroblastos para injeção
NOTA: Células cancerosas e fibroblastos devem ser injetados o mais rápido possível após a coleta, preferencialmente dentro de 30 minutos. Na manhã da injeção, colher as células cancerosas e fibroblastos separadamente das placas de cultura de tecido. Para cada tipo de célula, execute as seguintes etapas:
<ol><li>Retire o meio da placa de cultura de tecidos com sucção estéril suave ou pipetando o meio.</li>
	<li>Pipetar suavemente em 5 mL de PBS sem interromper as células. Gire o PBS. Aspirar suavemente o PBS com sucção ou pipetar fora do PBS.</li>
	<li>Pipetar suavemente 5 mL de tripsina-EDTA em PBS na camada de células e incubar por 5 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Remova as células da placa com toques suaves para desalojar as células. Pipetar as células várias vezes com uma pipeta de 10 mL e transferir as células para um tubo cônico contendo DMEM com FBS a 10%.</li>
	<li>Centrifugar os tubos cônicos a 180 x g por 5 minutos.</li>
	<li>Retire o sobrenadante despejando-o suavemente, retendo o pellet celular. Lave o pellet de célula duas vezes com PBS. De cada vez, pipetar 10 mL de PBS nas células. Misture suavemente com uma pipeta p1000.</li>
	<li>Centrifugar as células como no passo 5.5. Retire suavemente o PBS com uma pipeta e repita.</li>
	<li>Ressuspender as células peletizadas lavadas em 1 mL de PBS com p1000.</li>
	<li>Limpe uma lâmina do hemocitômetro com álcool e seque.</li>
	<li>Pipetar 100 μL da mistura celular em um tubo e adicionar 400 μL de azul de Trypan a 0,4% para uma concentração final de azul de Trypan de 0,32%.</li>
	<li>Encha suavemente as câmaras de um hemocitômetro de vidro sob a lamínula, pipetando a mistura celular até que a câmara esteja cheia.</li>
	<li>Usando um microscópio, concentre-se nas linhas de grade de uma objetiva de 10x.</li>
	<li>Conte as células vivas, sem manchas e as células azuis em um conjunto de 16 quadrados.</li>
	<li>Conte todos os 4 conjuntos de 16 quadrados.</li>
	<li>Faça a média da contagem de células para as células claras e azuis dos 4 conjuntos de 16 quadrados e multiplique por 10.000. Multiplique por 5 para corrigir a diluição de 1:5 do azul de Trypan.</li>
	<li>As contagens finais são a concentração em células/mL para as células viáveis e mortas. Multiplique pelo volume para determinar o número total de células cancerosas e fibroblastos. Confirme que a fração de células viáveis é de >80%.</li>
	<li>Confirmar que há um número suficiente de células de melanoma e fibroblastos para todas as injeções planejadas, supondo pelo menos 20% de perda de amostra durante as injeções.</li>
	<li>Transfira o número necessário de células para um novo tubo cônico e granule as células por centrifugação (180 x g por 5 minutos).</li>
	<li>Retire o sobrenadante com uma pipeta de 10 mL.</li>
	<li>Ressuspender o pellet na concentração necessária na quantidade apropriada de PBS grau da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) (50 μL por tumor para injeção intradérmica e 100 μL por tumor para injeção subcutânea).</li>
</ol>6. Injetar células cancerígenas e fibroblastos em camundongos
OBS: Se aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da instituição, injetar dois tumores em cada camundongo, um em cada flanco. Randomize qual mouse receberá qual injeção nos flancos direito e esquerdo. Dependendo do número de camundongos a serem injetados, anestesiar os camundongos e injetar células cancerígenas e fibroblastos nos camundongos em lotes.
<ol><li>Para injeção subcutânea de células cancerosas<ol><li>Anestesiar ratinhos conforme descrito na secção 4.1.</li>
		<li>Limpe a pele raspada com compressas com álcool.</li>
		<li>Encha uma seringa estéril com o volume desejado de células ou mistura de células e tampe a seringa com uma agulha de calibre 27. NOTA: Certifique-se de que não existem bolhas de ar. Mexa a seringa conforme necessário para remover as bolhas. Uma vez que as células tenham sido introduzidas na seringa, mantenha as células dentro das seringas bem misturadas, invertendo continuamente as seringas para evitar aglomeração.</li>
		<li>Insira a agulha na região subcutânea no flanco do rato e injete suavemente as células no rato. Use suspensão celular de 100 μL por tumor para injeção subcutânea (não é recomendado usar volume superior a 100 μL por injeção).</li>
		<li>Monitore os camundongos até que eles se recuperem da anestesia. Se necessário, forneça aos ratos materiais isolantes extras, como cabanas e/ou almofadas de aquecimento, para ajudar os ratos a se recuperarem totalmente.</li>
	</ol></li>
	<li>Para injeções intradérmicas de células cancerosas<ol><li>Anestesiar ratinhos conforme descrito na secção 4.1.</li>
		<li>Limpe a pele raspada com compressas com álcool.</li>
		<li>Encha uma seringa estéril com o volume desejado de células ou mistura de células e tampe a seringa com uma agulha de calibre 27. NOTA: Certifique-se de que não existem bolhas de ar. Mexa a seringa conforme necessário para remover as bolhas. Uma vez que as células tenham sido introduzidas na seringa, mantenha as células dentro das seringas bem misturadas, invertendo continuamente as seringas para evitar aglomeração.</li>
		<li>Insira uma agulha de calibre 27 na região intradérmica da pele no flanco do rato e injete suavemente as células na região intradérmica do rato. Use suspensão celular de 50μL por tumor para injeção intradérmica (não é recomendado usar volume superior a 50 μL por injeção).</li>
		<li>Monitore os camundongos até que eles se recuperem da anestesia. Se houver sinais de que os ratos estão em perigo, consulte um veterinário. Se necessário, forneça aos ratos materiais isolantes extras, como cabanas e/ou almofadas de aquecimento, para ajudar os ratos a se recuperarem totalmente.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Monitorar camundongos durante o crescimento do tumor
<ol><li>Monitore os ratos diariamente para quaisquer sinais de dor ou angústia (postura curvada, contorções, vocalização, alongamento ao longo da gaiola, pressionando seu abdômen para o fundo do chão da gaiola ou relutância em se mover ao redor da gaiola) ou formação de abscesso. Se houver sinais de que os ratos estão em perigo, consulte um veterinário.</li>
	<li>Uma vez que os tumores são formados, medir o volume do tumor aproximadamente a cada dois a três dias. Meça o comprimento do tumor (o lado mais longo) e a largura (perpendicular ao comprimento) com paquímetro. NOTA: As práticas recomendadas são para que a mesma pessoa execute essas medições durante todo o experimento para reduzir a variabilidade nos dados. Para medições, anestesiar ratinhos conforme descrito na secção 4.1</li>
	<li>Calcule os volumes tumorais com a fórmula Volume= 0,5 x (Comprimento x Largura2).</li>
</ol>8. Colher tumores e medir pesos tumorais
<ol><li>Eutanasiar camundongos quando o crescimento do tumor atingir um desfecho experimental estabelecido pelo Comitê de Cuidados com Animais da instituição. Coloque os ratos em uma câmara e eutanasie-os com deslocamento lento (20-30% por minuto) do ar da câmara com CO2 comprimido por um minuto após a interrupção da respiração.</li>
	<li>Realizar deslocamento cervical nos camundongos. Conter o roedor em uma superfície firme e plana. Coloque uma caneta resistente ou outro objeto contra a parte de trás do pescoço na base do crânio. Empurre rapidamente para frente e para baixo com o objeto segurando a cabeça enquanto puxa para trás com a mão segurando a base da cauda. Confirme com palpação que a medula espinhal está cortada. NOTA: A luxação cervical deve ser realizada por pessoal de laboratório experiente.</li>
	<li>Para cada rato na experiência, confirme se o rato já não está vivo, verificando se não há respiração, batimentos cardíacos e resposta a um beliscão do dedo do pé.</li>
	<li>Usando um bisturi estéril e tesoura cirúrgica, excise todo o tumor do rato. Com tesoura cirúrgica, corte o tecido não tumoral do tumor.</li>
	<li>Pesar o tumor em uma balança analítica e registrar o peso do tumor.</li>
</ol>9. Análise estatística dos volumes e pesos tumorais
<ol><li>Comparar os volumes tumorais ao longo do tempo em cada grupo com análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas. Realizar análise pareada se dois tumores foram injetados por camundongo.</li>
	<li>Comparar os pesos tumorais entre os grupos com ANOVA usando um teste bicaudal. O teste post-hoc de Tukey pode então ser usado para determinar quais grupos são significativamente diferentes uns dos outros. Realizar análise pareada se dois tumores foram injetados por camundongo.</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

No experimento da Figura 1, a co-introdução de fibroblastos dérmicos humanos com células humanas de melanoma A2058 resultou em tumores maiores do que quando as células de melanoma foram introduzidas sem fibroblastos co-injetados. Essa diferença pode ser facilmente detectada com base no volume e peso tumoral. Os resultados são consistentes com múltiplos relatos de que fibroblastos associados ao câncer podem promover o crescimento tumoral5,6,7,8.<sup...

Dentro do microambiente tumoral, um dos tipos celulares mais proeminentes é o fibroblasto associado ao câncer (CAF)1. Esses fibroblastos associados ao carcinoma podem desempenhar um papel supressor dotumor2,3. Por exemplo, fibroblastos que expressam S100A secretam colágenos que podem encapsular carcinógenos e proteger contra a formação de carcinomas4. Além disso, a depleção de miofibroblastos positivos para actina de músculo liso α (AME) no câncer de pâncreas causa imunossupressão e acelera a progressão do câncer de pâncreas2. As CAFs também podem co-evoluir com células cancerosas e promover a progressão tumoral 5,6,7,8. Os fibroblastos podem sintetizar e secretar proteínas da matriz extracelular que criam um ambiente promotor detumores8. Essas proteínas da matriz extracelular podem causar enrijecimento mecânico do tecido, que está associado à progressãotumoral9,10. A matriz extracelular depositada pode atuar como uma barreira física que inibe a infiltraçãoimunológica11. A deposição de matriz por CAFs também tem sido associada à invasão tumoral, uma vez que foi demonstrado que a fibronectina gerada por CAFs promove invasão tumoral12. As CAFs promovem angiogênese e recrutam células imunossupressoras para o microambiente tumoral, secretando fator transformador de crescimento-β (TGF-β), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), interleucina-6 (IL-6) e CXC-quimiocina ligante 12 (CXCL12)13,14,15. Devido ao seu papel central na promoção do crescimento tumoral, os fibroblastos associados ao câncer são um alvo emergente para a terapia antineoplásica 6,16,17,18.
O protocolo abaixo descreve um método para testar como os fibroblastos afetam o crescimento de tumores em um modelo de crescimento tumoral em camundongos bem estabelecido e amplamente utilizado. A fim de compreender a importância dos fibroblastos no microambiente tumoral, o protocolo padrão para introdução de células cancerosas em camundongos para monitorar seu crescimento foi modificado para incluir fibroblastos com a introdução de células cancerosas. As células cancerosas podem ser introduzidas por via subcutânea ou intradérmica. A introdução intradérmica resultaria em tumores que surgem da própria pele. Xenoenxertos nos quais células cancerosas e fibroblastos são co-injetados em camundongos representam uma importante ferramenta metodológica para dissecar o papel de fibroblastos, subpopulações de fibroblastos e fatores proteicos na capacidade de promover o crescimento do câncer19,20,21. Um protocolo detalhado para co-injeção de células cancerosas e fibroblastos em camundongos é fornecido. Esse método pode ser utilizado para comparar a presença ou ausência de fibroblastos, para comparar fibroblastos de diferentes fontes20 ou para comparar fibroblastos com e sem expressão de proteínas específicas19. Depois que as células cancerosas e fibroblastos são introduzidos, o tamanho do tumor pode ser monitorado ao longo do tempo. Ao final dos experimentos, os tumores podem ser dissecados e pesados. Ao monitorar o crescimento tumoral ao longo do tempo, a importância de diferentes fatores pode ser dissecada.
Existem possíveis abordagens alternativas para estudar o papel dos fibroblastos no crescimento tumoral. Como exemplo, existem modelos baseados em Cre-loxed que fornecem nocaute tecido-específico de genes com drivers expressos preferencialmente em fibroblastos. Tais abordagens também oferecem oportunidades para investigar o papel de genes e vias específicas em fibroblastos para a progressão tumoral. Em comparação com as abordagens baseadas em Cre-lox, o protocolo fornecido representaria uma abordagem significativamente mais rápida para monitorar o papel dos fibroblastos, pois o crescimento do tumor seria monitorado por apenas algumas semanas. A abordagem fornecida também é significativamente menos dispendiosa porque não requer a geração e alojamento de colónias de ratinhos geneticamente modificados. O protocolo fornecido pode ser usado para testar rapidamente o efeito do knockdown de diferentes genes usando shRNAs em vez de precisar desenvolver colônias de camundongos. A abordagem fornecida também é mais flexível, pois permitiria a comparação de diferentes números de fibroblastos, diferentes proporções de células cancerosas e fibroblastos, knockdown de diferentes genes e até mesmo comparação de fibroblastos de diferentes sítios ou espécies de tecidos. Uma abordagem Cre-lox teria a vantagem de que os fibroblastos estão presentes dentro dos camundongos em um contexto mais fisiológico.
O protocolo aqui relatado seria valioso para os cientistas que procuram monitorar os efeitos dos fibroblastos no crescimento do tumor de forma rápida e econômica. Este protocolo é especialmente valioso para os cientistas que investigam diferentes subgrupos de fibroblastos ou fibroblastos de diferentes fontes sobre o crescimento do tumor no crescimento do tumor. Se é importante que a iniciação do tumor ocorra em um contexto fisiológico, então modelos de camundongos geneticamente modificados devem ser considerados.
Existem várias abordagens possíveis para a realização desses experimentos. Camundongos imunocompetentes podem ser usados como hospedeiros, o que permitiria a investigação de interações fibroblasto-imune celular. Para modelos de camundongos imunocompetentes, células cancerosas de camundongos e fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) devem ser injetados. O uso de MEFs também permite que o investigador aproveite a ampla gama de linhagens de camundongos knockout para testar a presença ou ausência de um gene de interesse. Alternativamente, camundongos imunodeficientes podem ser usados para testar o papel dos fibroblastos humanos na promoção do crescimento de tumores em camundongos que são derivados de células cancerosas humanas. A introdução das células cancerosas pode ser realizada por via subcutânea ou ortotópica. Para o melanoma, como descrito abaixo, a mistura tumor-fibroblasto pode ser injetada por via intradérmica para injeção ortotópica que simula mais de perto o local dentro da pele onde um melanoma se desenvolveria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal clipper miniARCO with surgical blade #40</td>
			<td>WAHL Professional</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice (NU/J)</td>
			<td>The Jackson labs</td>
			<td>002019</td>
			<td>These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; CRL-11147&#8482;</td>
			<td>This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multi Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblasts&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS USP grade for injection into mice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-61A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue-culture grade PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterle 25 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 100 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 150 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 60 x 15 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth

Os fibroblastos associados ao câncer (CAFs) podem desempenhar um papel importante no crescimento tumoral, criando um microambiente promotor de tumores. Modelos para estudar o papel das CAFs no microambiente tumoral podem ser úteis para a compreensão da importância funcional de fibroblastos, fibroblastos de diferentes tecidos e fatores genéticos específicos em fibroblastos. Modelos murinos são essenciais para a compreensão dos contribuintes para o crescimento e progressão tumoral em um contexto in vivo. Aqui, um protocolo em que células cancerosas são misturadas com fibroblastos e introduzidas em camundongos para desenvolver tumores é fornecido. O tamanho do tumor ao longo do tempo e o peso final do tumor são determinados e comparados entre os grupos. O protocolo descrito pode fornecer mais informações sobre o papel funcional das CAFs no crescimento e progressão tumoral.

Células de melanoma humano A2058 e fibroblastos dérmicos humanos primários foram cultivados em condições estéreis. As células foram coletadas e lavadas três vezes com PBS. Camundongos imunodeficientes (NU/J - cepa Foxn1 nude) foram injetados por via subcutânea em um flanco com 0,25 milhão de células de melanoma A2058 isoladamente. No outro flanco, camundongos foram injetados com uma mistura de 0,25 milhão de células de melanoma A2058 e 0,75 milhão de fibroblastos. As célula...

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A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Um protocolo para co-injetar células cancerosas e fibroblastos e monitorar o crescimento do tumor ao longo do tempo é fornecido. Este protocolo pode ser utilizado para entender as bases moleculares do papel dos fibroblastos como reguladores do crescimento tumoral.

Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

4.3K visualizações.  University of California, Los Angeles. Um protocolo para co-injetar células cancerosas e fibroblastos e monitorar o crescimento do tumor ao longo do tempo é fornecido. Este protocolo pode ser utilizado para entender as bases moleculares do papel dos fibroblastos como reguladores do crescimento tumoral.

Vídeo: A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Enxertia de tumor em um modelo do rato de enxerto heterólogo de linfoma de células do manto humano

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Pesquisa do câncer

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental enrichment (EE) reduces tumorigenesis by activating the mouse immune system, or affects tumor bearing animal survival by stimulating the wound repair response, including improved microbiome diversity, in the tumor microenvironment. Provided here is a detailed procedure to assess the effects of environmental enrichment on the biodiversity of the microbiome in a mouse colon tumor model. Precautions regarding animal breeding and considerations for animal genotype and mouse colony integration are described, all of which ultimately affect microbial biodiversity. Heeding these precautions may allow more uniform microbiome transmission, and consequently will alleviate non-treatment dependent effects that can confound study findings. Further, in this procedure, microbiota changes are characterized using 16S rDNA sequencing of DNA isolated from stool collected from the distal colon following long-term environmental enrichment. Gut microbiota imbalance is associated with the pathogenesis of inflammatory bowel disease and colon cancer, but also of obesity and diabetes among others. Importantly, this protocol for EE and microbiome analysis can be utilized to study the role of microbiome pathogenesis across a variety of diseases where robust mouse models exist that can recapitulate human disease.

Environmental Enrichment (EE) is an animal housing environment that is used to reveal mechanisms that underlie the connections between lifestyle, stress, and disease. This protocol describes a procedure that uses a mouse model of colon tumorigenesis and EE to specifically define alterations in microbiota biodiversity that may impact animal mortality.

Um método para definir os efeitos do enriquecimento ambiental sobre a biodiversidade de Microbiome cólon em um modelo de Tumor de cólon de Mouse

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

Enriquecimento de Fosfopeptida acoplado com espectrometria de massa livre de rótulo quantitativa para investigar o Phosphoproteome no câncer de próstata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ever-increasing number of studies have identified miRNAs as potential biomarkers for cancer diagnosis and prognosis, and also as therapeutic targets, adding an extra dimension to cancer evaluation and treatment. In the context of thyroid cancer, tumorigenesis results not only from mutations in important genes, but also from the overexpression of many miRNAs. Accordingly, the role of miRNAs in the control of thyroid gene expression is evolving as an important mechanism in cancer. Herein, we present a protocol to examine the effects of miRNA-inhibitor delivery as a therapeutic modality in thyroid cancer using human tumor xenograft and orthotopic mouse models. After engineering stable thyroid tumoral cells expressing GFP and luciferase, cells are injected into nude mice to develop tumors, which can be followed by bioluminescence. The in vivo inhibition of a miRNA can reduce tumor growth and upregulate miRNA gene targets. This method can be used to assess the importance of a determined miRNA in vivo, in addition to identifying new therapeutic targets.

This protocol describes xenograft and orthotopic mouse models of human thyroid tumorigenesis as a platform to test microRNA-based inhibitor treatments. This approach is ideal to study the function of non-coding RNAs and their potential as new therapeutic targets.

In vivo inibição de MicroRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables associated to specific pancreatic pathologies to help preoperative differential diagnosis and patient profiling. Pancreatic juice is a relatively unexplored body fluid, which, due to its close proximity to the tumor site, reflects changes in the surrounding tissue. Here we describe in detail the intraoperative collection procedure. Unfortunately, translating pancreatic juice collection to murine models of PDAC, to perform mechanistic studies, is technically very challenging. Tumor interstitial fluid (TIF) is the extracellular fluid, outside blood and plasma, which bathes tumor and stromal cells. Similarly to pancreatic juice, for its property to collect and concentrate molecules that are found diluted in plasma, TIF can be exploited as an indicator of microenvironmental alterations and as a valuable source of disease-associated biomarkers. Since TIF is not readily accessible, various techniques have been proposed for its isolation. We describe here two simple and technically undemanding methods for its isolation: tissue centrifugation and tissue elution.

Pancreatic juice is a precious source of biomarkers for human pancreatic cancer. We describe here a method for intraoperative collection procedure. To overcome the challenge of adopting this procedure in murine models, we suggest an alternative sample, tumor interstitial fluid, and describe here two protocols for its isolation.

Isolamento de Fluidos Proximais para Investigar o Microambiente Tumoral do Adenocarcinoma Pancreático

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor cells, CAFs regulate tumor progression and provide protection from antitumor immunity. Emerging anticancer strategies aim to remodel the tumor microenvironment through the ablation of pro-tumorigenic CAFs or reprogramming of CAFs functions and their activation status. A promising approach is the development of nanosized delivery agents able to target CAFs, thus allowing the specific delivery of drugs and active molecules. In this context, a cellular model of CAFs may provide a useful tool for in vitro screening and preliminary investigation of such nanoformulations.
This study describes the isolation and culture of primary CAFs from the syngeneic 4T1 murine model of triple-negative breast cancer. Magnetic beads were used in a 2-step separation process to extract CAFs from dissociated tumors. Immunophenotyping control was performed using flow cytometry after each passage to verify the process yield. Isolated CAFs can be employed to study the targeting capability of different nanoformulations designed to tackle the tumor microenvironment. Fluorescently labeled H-ferritin nanocages were used as candidate nanoparticles to set up the method. Nanoparticles, either bare or conjugated with a targeting ligand, were analyzed for their binding to CAFs. The results suggest that ex vivo extraction of breast CAFs may be a useful system to test and validate nanoparticles for the specific targeting of tumorigenic CAFs.

This paper aims to provide a protocol for the isolation and culture of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of triple-negative breast cancer and their application for the preclinical study of novel nanoparticles designed to target the tumor microenvironment.&#160;

Isolamento de fibroblastos associados ao câncer primário de um modelo de murina síndica do câncer de mama para o estudo de nanopartículas-alvo

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Um modelo esferoide tridimensional para investigar a interação tumoral-estroma em carcinoma hepatocelular

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...