Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Coller per l'utile contributo. H.A.C. era lo studioso Milton E. Cassel della Rita Allen Foundation. Riconosciamo NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanoma Research Alliance Team Science Award, Cancer Research Institute Clinical Laboratory Integration Program Award, Iris Cantor Women's Health Center / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, University of California Cancer Research Coordinating Committee, David Geffen School of Medicine Metabolism Theme Award, Clinical Translational Science Institute e Jonsson Comprehensive Cancer Center, Innovation Awards dal Broad Stem Cell Research Center (Rose Hills e Ha Gaba), un premio dall'UCLA SPORE in Prostate Cancer (National Cancer Institute of the National Institutes of Health con il numero di premio P50CA092131), un premio per l'innovazione dal Broad Stem Cell Center, l'Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research dell'UCLA, il Tumor Cell Biology Training Program (USHHS Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award # T32 CA009056), il Dermatology T32 Program presso UCLA AR071307 e l'UCLA Muscle Cell Biology, Pathophysiology and Therapeutics T32 Training Program 5 T32 AF 65972.

Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dall'Animal Care Committee dell'Università della California, Los Angeles.
NOTA: Selezionare le cellule tumorali e i fibroblasti che corrispondono ai topi ospiti per il ceppo di topo. Selezionare le cellule tumorali e i fibroblasti che corrispondono al sesso del topo ospite. Ottieni topi da colonie riproduttive o acquistali da fornitori affidabili. Introdurre tumori nei topi che sono ~ 8-10 settimane di età. I topi con pelliccia saranno nella fase telogen o di riposo del ciclo del follicolo pilifero. Piano per un rapporto di 0,5 a 3 fibroblasti per cellula tumorale.
1. Determinare il numero appropriato di topi da utilizzare per la sperimentazione
<ol><li>Prima di eseguire gli studi, eseguire un'analisi della potenza per determinare il numero appropriato di topi da utilizzare per gli studi. Utilizzare la formula seguente per determinare la dimensione del campione per un esperimento con la potenza specificata: n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2 Se α è il livello di significatività selezionato (di solito 0,05), allora 1-α/2 = 0,975 e Z = 1,960. β è la potenza e se si desidera l'80% di potenza, allora Z = 0,84. ES, dimensione dell'effetto = \μ1-μ 0\/σ dove μ 0 è la media sotto l'ipotesi H0, μ 1 è la media sotto l'ipotesi H1 e σ è la deviazione standard del risultato dell'interesse22. NOTA: ulteriori informazioni sul calcolo della dimensione del campione sono disponibili22.</li>
</ol>2. Generare cellule tumorali per iniezione
<ol><li>Determinare il tasso di crescita rilevante con la seguente equazione: Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t NOTA: viene mostrato un esempio per le celle che raddoppiano in 24 ore Tempo di raddoppio = ln(2)/tasso di crescita 24 ore = LN(2)/tasso di crescita 24*tasso di crescita = .693 Tasso di crescita = .693/24= .028875</li>
	<li>Determinare il numero di cellule tumorali da placcare e la quantità di tempo in cui le cellule devono essere coltivate prima dell'iniezione. NOTA: 0,25-1 milione di cellule tumorali vengono iniettate per ogni tumore formato.</li>
	<li>Calcolare il numero di giorni necessari per generare un numero sufficiente di celle in base all'equazione N(t)=N(0)egr*t dove N(t) è il numero di celle al tempo t, N(0) è il numero di celle al tempo 0, gr è il tasso di crescita e t è il tempo. NOTA: Un esempio di questi calcoli per la crescita di 500.000 cellule per generare 106 cellule in ciascuno dei 12 tumori. Sulla base di questi calcoli, 5 giorni sono sufficienti per far crescere il numero necessario di cellule: N(t)=N(0)egr*t 12 x 106 = 500.000e(gr*t) 12 x 106=500.000e(.028875*t) 24=e(.028875*x) ln(24)=0,028875x 3,178=0,028875x X=110 ore= 4,59 giorni Concedere più tempo per le celle da attaccare alla piastra e per le celle che vengono perse durante la raccolta.</li>
	<li>Cellule tumorali a piastra. NOTA: Indossare guanti e camici da laboratorio quando si lavora con cellule in coltura. NOTA: Eseguire manipolazioni cellulari in una cappa a flusso laminare per ridurre al minimo l'introduzione di microbi dall'aria nei campioni. Trattare la cappa di coltura tissutale con luce ultravioletta prima dell'uso. Utilizzare la tecnica sterile e solo articoli di plastica e materiali di consumo per colture cellulari sterili come piastre trattate con colture tissutali, pipet e tubi conici.<ol><li>Calcolare il numero e la dimensione corretti delle piastre di coltura tissutale in base al numero di cellule nel flaconcino e alla concentrazione cellulare desiderata una volta placcate.</li>
		<li>Etichettare le piastre di coltura tissutale.</li>
		<li>Preparare un bagnomaria con acqua a 37 °C.</li>
		<li>Mezzo aliquota in tubi conici e posto a bagnomaria a 37 °C. Molte cellule tumorali possono essere coltivate nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS).</li>
		<li>Rimuovere il numero richiesto di flaconcini di celle congelate dal congelatore di azoto liquido. NOTA: Utilizzare guanti da congelatore quando si maneggiano le celle in un congelatore ad azoto liquido.</li>
		<li>Scongelare rapidamente le fiale di cellule a bagnomaria agitando delicatamente. NOTA: Aggiungere etanolo ai guanti mentre si maneggiano le fiale per mantenere la sterilità.</li>
		<li>Utilizzando la tecnica sterile in una cappa di coltura tissutale, pipetare le cellule in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di DMEM + 10% FBS.</li>
		<li>Centrifugare la miscela cellulare a 180 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Rimuovere delicatamente il surnatante con aspirazione sterile o un pipet sterile da 10 ml.</li>
		<li>Risospendere delicatamente le cellule nel pellet in 1 mL di DMEM + 10% FBS.</li>
		<li>Pipet le cellule risospese su una piastra di coltura tissutale etichettata con un p1000 sterile.</li>
		<li>Utilizzando pipet sterili da 10 ml, mezzo pipetta con siero in piastre di coltura tissutale.</li>
		<li>Incubare piastre di coltura tissutale in un incubatore per colture tissutali a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Espandere le cellule tumorali per generare cellule tumorali sufficienti per l'iniezione. NOTA: monitorare le celle con microscopia ottica per la confluenza. Tripsinizzare ogni due o tre giorni o secondo necessità per evitare che le cellule raggiungano il 100% di confluenza. Se è necessario un gran numero di celle, utilizzare hyperflask (Table of Materials) per far crescere un gran numero di celle in modo spaziale e mediamente efficiente. Ogni volta che le celle devono essere passate, seguire questa procedura:<ol><li>Rimuovere il mezzo dalla piastra con aspirazione sterile o un pipet sterile da 10 ml.</li>
		<li>Lavare delicatamente la piastra mediante pipettaggio su soluzione salina tamponata fosfato caldo (PBS). Quindi rimuovere il PBS con aspirazione sterile o un pipet.</li>
		<li>Pipet 5 mL di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS per una piastra di 10 cm sulle cellule e incubare per 5 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Rimuovere le cellule dalla piastra con colpetti delicati per rimuovere le cellule dalla piastra.</li>
		<li>Utilizzando un pipet sterile da 10 ml, raccogliere le cellule in DMEM con siero FBS al 10% in provette coniche.</li>
		<li>Centrifugare i tubi conici a 180 x g per 5 minuti.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante versandolo via. Il pellet cellulare dovrebbe essere visibile. Guardalo per assicurarti che rimanga nel tubo.</li>
		<li>Risospendere le celle pellettate aggiungendo 1 mL di DMEM + 10% FBS e pipettando su e giù delicatamente.</li>
		<li>Aliquot ha risospeso le cellule su nuove piastre di coltura tissutale della dimensione appropriata con DMEM + 10% FBS (10 ml di terreno sono adatti per una piastra di coltura tissutale da 10 cm).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Generare fibroblasti per iniezione
NOTA: I fibroblasti primari senesino dopo troppi raddoppi / passaggi. È importante utilizzare fibroblasti primari dopo un numero limitato di passaggi o raddoppi. Tieni traccia del numero di passaggi o raddoppi che i fibroblasti hanno cresciuto dal topo o dalla pelle umana. Utilizzare fibroblasti con meno di 15 passaggi per fibroblasti dermici umani primari. Utilizzare fibroblasti con meno di 9 passaggi per fibroblasti embrionali di topo. I fibroblasti sono alterati quando diventano confluenti. Tripsinizzare i fibroblasti quando sono circa il 90% confluenti. I fibroblasti avranno proprietà diverse a seconda di come vengono coltivati. Molti scienziati promuovono la coltura su substrati fisiologicamente più rilevanti rispetto alle piastre di coltura tissutale come le matrici di collagene 3D che catturano in modo più efficace ambienti simili ai tessuti23,24,25.
<ol><li>Utilizzare l'equazione nella sezione 2.1 per determinare il tasso di crescita delle cellule dei fibroblasti.</li>
	<li>Utilizzare l'equazione nella sezione 2.2 per determinare il numero di giorni necessari per espandere i fibroblasti.</li>
	<li>Placcare i fibroblasti come descritto nel paragrafo 2.3 utilizzando il mezzo appropriato nel giorno appropriato per garantire che le cellule tumorali e i fibroblasti siano pronti per l'iniezione lo stesso giorno.</li>
	<li>Espandere i fibroblasti nel mezzo appropriato per generare un numero sufficiente di fibroblasti necessari seguendo le procedure descritte nel paragrafo 2.4.</li>
</ol>4. Radere i topi per preparare i topi per l'iniezione
NOTA: Indossare camici da laboratorio, retine per capelli, copriscarpe e guanti quando si lavora con i topi.
<ol><li>Uno o due giorni prima dell'iniezione, in conformità con le regole del Comitato istituzionale per la cura degli animali, anestetizzare i topi. Se si utilizza l'isoflurano per l'anestesia, utilizzare una miscela di isoflurano e O2. Mettere i topi in una camera di anestesia e introdurre una miscela di isoflurano (5%)/ O2 per indurre l'anestesia. Quindi, posizionare il cono nasale sull'animale anestetizzato per mantenere il piano chirurgico dell'anestesia con un flusso costante di miscela di isoflurano (2%)/O2 .</li>
	<li>Controllare gli animali per assicurarsi che siano nel piano chirurgico appropriato di anestesia pizzicando la punta del topo e confermando che il topo non si muove.</li>
	<li>Utilizzando un tagliacapelli con lama chirurgica #40, rimuovere delicatamente la pelliccia dalle posizioni appropriate sui fianchi dei topi passando il tagliacapelli sulla pelle più volte fino a quando la pelliccia non viene rimossa.</li>
	<li>Monitorare i topi fino a quando non si riprendono dall'anestesia.</li>
</ol>5. Preparare le cellule tumorali e i fibroblasti per l'iniezione
NOTA: Le cellule tumorali e i fibroblasti devono essere iniettati il più presto possibile dopo la raccolta, preferibilmente entro 30 minuti. La mattina dell'iniezione, raccogliere le cellule tumorali e i fibroblasti separatamente dalle piastre di coltura tissutale. Per ogni tipo di cella eseguire la procedura seguente:
<ol><li>Rimuovere il terreno dalla piastra di coltura tissutale con una delicata aspirazione sterile o mediante pipettaggio del mezzo.</li>
	<li>Pipettare delicatamente su 5 ml di PBS senza interrompere le cellule. Ruota il PBS. Aspirare delicatamente il PBS con aspirazione o pipettare il PBS.</li>
	<li>Versare delicatamente 5 mL di tripsina-EDTA in PBS sullo strato cellulare e incubare per 5 minuti a 37 °C.</li>
	<li>Rimuovere le cellule dalla piastra con colpetti delicati per rimuovere le cellule. Pipet le cellule più volte con un pipet da 10 mL e trasferire le cellule in un tubo conico contenente DMEM con FBS al 10%.</li>
	<li>Centrifugare i tubi conici a 180 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante versandolo delicatamente, trattenendo il pellet cellulare. Lavare il pellet cellulare due volte con PBS. Ogni volta, pipettare 10 ml di PBS sulle cellule. Mescolare delicatamente con un pipet p1000.</li>
	<li>Centrifugare le cellule come al punto 5.5. Rimuovere delicatamente il PBS con una pipetta e ripetere.</li>
	<li>Risospendere le celle lavate e pellettate in 1 ml di PBS con un p1000.</li>
	<li>Pulire un vetrino emocitometrico con alcool e asciugare.</li>
	<li>Pipet 100 μL della miscela cellulare in un tubo e aggiungere 400 μL di 0,4% blu Trypan per una concentrazione finale di blu Trypan dello 0,32%.</li>
	<li>Riempire delicatamente le camere di un emocitometro in vetro sotto il vetrino di copertura pipettando la miscela cellulare fino a quando la camera è piena.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio, concentrati sulle linee della griglia di un obiettivo 10x.</li>
	<li>Conta le celle vive, non colorate e le celle blu in una serie di 16 quadrati.</li>
	<li>Conta tutti e 4 i set di 16 quadrati.</li>
	<li>Calcola la media del conteggio delle celle chiare e blu dai 4 set di 16 quadrati e moltiplica per 10.000. Moltiplicare per 5 per correggere la diluizione 1:5 dal blu Trypan.</li>
	<li>I conteggi finali sono la concentrazione in cellule/ml per le cellule vitali e morte. Moltiplicare per il volume per determinare il numero totale di cellule tumorali e fibroblasti. Confermare che la frazione di cellule vitali è >80%.</li>
	<li>Confermare che ci sia un numero sufficiente di cellule di melanoma e fibroblasti per tutte le iniezioni pianificate, ipotizzando una perdita di almeno il 20% del campione durante le iniezioni.</li>
	<li>Trasferire il numero necessario di celle in un nuovo tubo conico e pellettare le celle mediante centrifugazione (180 x g per 5 minuti).</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con un pipet da 10 ml.</li>
	<li>Risospendere il pellet alla concentrazione richiesta nella quantità appropriata di PBS di grado della Farmacopea degli Stati Uniti (USP) (50 μL per tumore per iniezione intradermica e 100 μL per tumore per iniezione sottocutanea).</li>
</ol>6. Iniettare cellule tumorali e fibroblasti nei topi
NOTA: Se approvato dal Comitato istituzionale per la cura degli animali, iniettare due tumori in ciascun topo, uno su ciascun fianco. Randomizzare quale topo riceverà quale iniezione sui fianchi destro e sinistro. A seconda del numero di topi da iniettare, anestetizzare i topi e iniettare cellule tumorali e fibroblasti nei topi in lotti.
<ol><li>Per iniezione sottocutanea di cellule tumorali<ol><li>Anestetizzare i topi come descritto nel paragrafo 4.1.</li>
		<li>Pulire la pelle rasata con tamponi imbevuti di alcool.</li>
		<li>Riempire una siringa sterile con il volume desiderato di cellule o miscela cellulare e tappare la siringa con un ago da 27 gauge. NOTA: assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Sfogliare la siringa secondo necessità per rimuovere le bolle. Una volta che le cellule sono state introdotte nella siringa, mantenere le cellule all'interno delle siringhe ben miscelate invertendo continuamente le siringhe per evitare l'aggregazione.</li>
		<li>Inserire l'ago nella regione sottocutanea sul fianco del topo e iniettare delicatamente le cellule nel topo. Utilizzare 100 μL di sospensione cellulare per tumore per iniezione sottocutanea (l'uso di volume superiore a 100 μL per iniezione non è raccomandato).</li>
		<li>Monitorare i topi fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Se necessario, fornire ai topi materiali isolanti extra come capanne e / o termofori per aiutare i topi a riprendersi completamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Per iniezioni intradermiche di cellule tumorali<ol><li>Anestetizzare i topi come descritto nel paragrafo 4.1.</li>
		<li>Pulire la pelle rasata con tamponi imbevuti di alcool.</li>
		<li>Riempire una siringa sterile con il volume desiderato di cellule o miscela cellulare e tappare la siringa con un ago da 27 gauge. NOTA: assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Sfogliare la siringa secondo necessità per rimuovere le bolle. Una volta che le cellule sono state introdotte nella siringa, mantenere le cellule all'interno delle siringhe ben miscelate invertendo continuamente le siringhe per evitare l'aggregazione.</li>
		<li>Inserire un ago di calibro 27 nella regione intradermica della pelle sul fianco del topo e iniettare delicatamente le cellule nella regione intradermica del topo. Utilizzare 50 μL di sospensione cellulare per tumore per iniezione intradermica (l'uso di volume superiore a 50 μL per iniezione non è raccomandato).</li>
		<li>Monitorare i topi fino a quando non si riprendono dall'anestesia. Se ci sono segni che i topi sono in difficoltà, consultare un veterinario. Se necessario, fornire ai topi materiali isolanti extra come capanne e / o termofori per aiutare i topi a riprendersi completamente.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Monitorare i topi durante la crescita del tumore
<ol><li>Monitorare quotidianamente i topi per eventuali segni di dolore o angoscia (postura curva, contorcersi, vocalizzazione, allungarsi lungo la gabbia, premere l'addome sul fondo del pavimento della gabbia o riluttanza a muoversi intorno alla gabbia) o formazione di ascessi. Se ci sono segni che i topi sono in difficoltà, consultare un veterinario.</li>
	<li>Una volta formati i tumori, misurare il volume del tumore circa ogni due o tre giorni. Misurare la lunghezza del tumore (il lato più lungo) e la larghezza (perpendicolare alla lunghezza) con le pinze. NOTA: le procedure consigliate prevedono che la stessa persona esegua queste misurazioni durante l'esperimento per ridurre la variabilità dei dati. Per le misurazioni, anestetizzare i topi come descritto nel paragrafo 4.1</li>
	<li>Calcolare i volumi tumorali con la formula Volume = 0,5 x (Lunghezza x Larghezza2).</li>
</ol>8. Raccogliere tumori e misurare i pesi tumorali
<ol><li>Eutanasia dei topi quando la crescita tumorale raggiunge un endpoint sperimentale stabilito dal Comitato dell'istituzione per la cura degli animali. Metti i topi in una camera e eutanasiali con uno spostamento lento (20-30% al minuto) dell'aria della camera con CO2 compresso per un minuto dopo la cessazione della respirazione.</li>
	<li>Eseguire la dislocazione cervicale sui topi. Trattenere il roditore su una superficie solida e piana. Posizionare una penna robusta o un altro oggetto contro la parte posteriore del collo alla base del cranio. Spingere rapidamente in avanti e verso il basso con l'oggetto che trattiene la testa mentre si tira indietro con la mano che tiene la base della coda. Confermare con la palpazione che il midollo spinale è reciso. NOTA: La dislocazione cervicale deve essere eseguita da personale di laboratorio esperto.</li>
	<li>Per ogni topo nell'esperimento, confermare che il topo non è più vivo controllando che non ci sia respirazione, battito cardiaco e nessuna risposta a un pizzico del piede.</li>
	<li>Usando un bisturi sterile e forbici chirurgiche, asportare l'intero tumore dal topo. Con le forbici chirurgiche, tagliare il tessuto non tumorale dal tumore.</li>
	<li>Pesare il tumore su una bilancia analitica e registrare il peso del tumore.</li>
</ol>9. Analisi statistica dei volumi e dei pesi tumorali
<ol><li>Confrontare i volumi tumorali nel tempo in ciascun gruppo con l'analisi della varianza con misure ripetute (ANOVA). Eseguire analisi accoppiate se sono stati iniettati due tumori per topo.</li>
	<li>Confrontare i pesi tumorali tra i gruppi con ANOVA utilizzando un test a due code. Il test post-hoc di Tukey può quindi essere utilizzato per determinare quali gruppi sono significativamente diversi l'uno dall'altro. Eseguire analisi accoppiate se sono stati iniettati due tumori per topo.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nell'esperimento nella Figura 1, la co-introduzione di fibroblasti dermici umani con cellule di melanoma umano A2058 ha provocato tumori più grandi rispetto a quando le cellule di melanoma sono state introdotte senza fibroblasti co-iniettati. Questa differenza potrebbe essere facilmente rilevata in base al volume del tumore e al peso del tumore. I risultati sono coerenti con molteplici segnalazioni che i fibroblasti associati al cancro possono promuovere la crescita ...

All'interno del microambiente tumorale, uno dei tipi di cellule più importanti è il fibroblasto associato al cancro (CAF)1. Questi fibroblasti associati al carcinoma possono svolgere un ruolo soppressivo del tumore 2,3. Ad esempio, i fibroblasti che esprimono S100A secernono collageni che possono incapsulare agenti cancerogeni e proteggere dalla formazione di carcinoma4. Inoltre, l'esaurimento dei miofibroblasti positivi all'actina α-liscia (SMA) nel cancro del pancreas provoca immunosoppressione e accelera la progressione del cancro del pancreas2. I CAF possono anche co-evolvere con le cellule tumorali e promuovere la progressione tumorale 5,6,7,8. I fibroblasti possono sintetizzare e secernere proteine della matrice extracellulare che creano un ambiente che promuove il tumore8. Queste proteine della matrice extracellulare possono causare irrigidimento meccanico del tessuto, che è associato alla progressione del tumore 9,10. La matrice extracellulare depositata può agire come una barriera fisica che inibisce l'infiltrazione immunitaria11. La deposizione di matrice da parte dei CAF è stata anche associata all'invasione tumorale poiché la fibronectina generata dai CAF ha dimostrato di promuovere l'invasione tumorale12. I CAF promuovono l'angiogenesi e reclutano cellule immunosoppressive nel microambiente tumorale secernendo il fattore di crescita trasformante β (TGF-β), il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), l'interleuchina-6 (IL-6) e il ligando CXC-chemochine 12 (CXCL12) 13,14,15. A causa del loro ruolo centrale nel promuovere la crescita tumorale, i fibroblasti associati al cancro sono un bersaglio emergente per la terapia anti-cancro 6,16,17,18.
Il protocollo seguente descrive un metodo per testare come i fibroblasti influenzano la crescita dei tumori in un modello murino di crescita tumorale ben consolidato e ampiamente utilizzato. Al fine di comprendere l'importanza dei fibroblasti nel microambiente tumorale, il protocollo standard per l'introduzione di cellule tumorali nei topi per monitorare la loro crescita è stato modificato per includere i fibroblasti con l'introduzione delle cellule tumorali. Le cellule tumorali possono essere introdotte per via sottocutanea o intradermica. L'introduzione intradermica provocherebbe tumori che derivano dalla pelle stessa. Gli xenotrapianti in cui cellule tumorali e fibroblasti vengono co-iniettati nei topi rappresentano un importante strumento metodologico per sezionare il ruolo dei fibroblasti, sottopopolazioni di fibroblasti e fattori proteici nella capacità di promuovere la crescita del cancro 19,20,21. Viene fornito un protocollo dettagliato per la co-iniezione di cellule tumorali e fibroblasti nei topi. Questo metodo può essere utilizzato per confrontare la presenza o l'assenza di fibroblasti, per confrontare fibroblasti provenienti da fonti diverse20, o per confrontare fibroblasti con e senza espressione di proteine specifiche19. Dopo l'introduzione delle cellule tumorali e dei fibroblasti, la dimensione del tumore può essere monitorata nel tempo. Alla fine degli esperimenti, i tumori possono essere sezionati e pesati. Monitorando la crescita del tumore nel tempo, è possibile sezionare l'importanza di diversi fattori.
Esistono possibili approcci alternativi per studiare il ruolo dei fibroblasti nella crescita tumorale. Ad esempio, ci sono modelli basati su Cre-lox che prevedono il knockout tessuto-specifico di geni con driver espressi preferenzialmente nei fibroblasti. Tali approcci offrono anche l'opportunità di studiare il ruolo di geni e percorsi specifici nei fibroblasti per la progressione del tumore. Rispetto agli approcci basati su Cre-lox, il protocollo fornito rappresenterebbe un approccio significativamente più rapido al monitoraggio del ruolo dei fibroblasti perché la crescita del tumore verrebbe monitorata in poche settimane. L'approccio fornito è anche significativamente meno costoso perché non richiede la generazione e l'alloggiamento di colonie di topi geneticamente modificati. Il protocollo fornito può essere utilizzato per testare rapidamente l'effetto del knockdown di diversi geni utilizzando shRNA piuttosto che dover sviluppare colonie di topi. L'approccio fornito è anche più flessibile perché consentirebbe un confronto tra diversi numeri di fibroblasti, diversi rapporti di cellule tumorali e fibroblasti, abbattimento di geni diversi e persino confronto di fibroblasti da diversi siti o specie di tessuti. Un approccio Cre-lox avrebbe il vantaggio che i fibroblasti sono presenti all'interno dei topi in un contesto più fisiologico.
Il protocollo qui riportato sarebbe prezioso per gli scienziati che cercano di monitorare gli effetti dei fibroblasti sulla crescita del tumore in modo rapido ed economico. Questo protocollo è particolarmente prezioso per gli scienziati che studiano diversi sottoinsiemi di fibroblasti o fibroblasti da diverse fonti sulla crescita del tumore sulla crescita del tumore. Se è importante che l'inizio del tumore avvenga in un contesto fisiologico, dovrebbero essere presi in considerazione modelli murini geneticamente modificati.
Esistono diversi approcci possibili per eseguire questi esperimenti. I topi immunocompetenti possono essere utilizzati come ospiti, il che consentirebbe di studiare le interazioni fibroblasto-cellule immunitarie. Per i modelli murini immunocompetenti, devono essere iniettate cellule tumorali di topo e fibroblasti embrionali di topo (MEF). L'uso di MEF consente inoltre allo sperimentatore di sfruttare l'ampia gamma di ceppi murini knockout per testare la presenza o l'assenza di un gene di interesse. In alternativa, i topi immunodeficienti possono essere utilizzati per testare il ruolo dei fibroblasti umani nel promuovere la crescita dei tumori nei topi derivati da cellule tumorali umane. L'introduzione delle cellule tumorali può essere eseguita per via sottocutanea o ortotopica. Per il melanoma, come descritto di seguito, la miscela tumore-fibroblasto può essere iniettata per via intradermica per iniezione ortotopica che simula più da vicino la posizione all'interno della pelle in cui si svilupperebbe un melanoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal clipper miniARCO with surgical blade #40</td>
			<td>WAHL Professional</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice (NU/J)</td>
			<td>The Jackson labs</td>
			<td>002019</td>
			<td>These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; CRL-11147&#8482;</td>
			<td>This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multi Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblasts&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS USP grade for injection into mice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-61A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue-culture grade PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterle 25 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 100 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 150 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 60 x 15 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth

I fibroblasti associati al cancro (CAF) possono svolgere un ruolo importante nella crescita del tumore creando un microambiente che promuove il tumore. I modelli per studiare il ruolo dei CAF nel microambiente tumorale possono essere utili per comprendere l'importanza funzionale dei fibroblasti, dei fibroblasti di diversi tessuti e di specifici fattori genetici nei fibroblasti. I modelli murini sono essenziali per comprendere i fattori che contribuiscono alla crescita e alla progressione del tumore in un contesto in vivo. Qui, viene fornito un protocollo in cui le cellule tumorali vengono mescolate con fibroblasti e introdotte nei topi per sviluppare tumori. Le dimensioni del tumore nel tempo e i pesi finali del tumore sono determinati e confrontati tra i gruppi. Il protocollo descritto può fornire maggiori informazioni sul ruolo funzionale dei CAF nella crescita e nella progressione del tumore.

A2058 cellule di melanoma umano e fibroblasti dermici umani primari sono stati coltivati in condizioni sterili. Le cellule sono state raccolte e lavate tre volte con PBS. Topi immunodeficienti (NU/J - ceppo nudo Foxn1) sono stati iniettati per via sottocutanea su un fianco con 0,25 milioni di cellule di melanoma A2058 da sole. Sull'altro lato, ai topi è stata iniettata una miscela di 0,25 milioni di cellule di melanoma A2058 e 0,75 milioni di fibroblasti. Le cellule sono state iniettate ...

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A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Viene fornito un protocollo per co-iniettare cellule tumorali e fibroblasti e monitorare la crescita del tumore nel tempo. Questo protocollo può essere utilizzato per comprendere le basi molecolari del ruolo dei fibroblasti come regolatori della crescita tumorale.

Un modello murino per studiare il ruolo dei fibroblasti associati al cancro nella crescita tumorale

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

4.3K Views.  University of California, Los Angeles. Viene fornito un protocollo per co-iniettare cellule tumorali e fibroblasti e monitorare la crescita del tumore nel tempo. Questo protocollo può essere utilizzato per comprendere le basi molecolari del ruolo dei fibroblasti come regolatori della crescita tumorale.

Video: A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Attecchimento del tumore in un modello murino di xenotrapianto di umano linfoma a cellule mantellari

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental enrichment (EE) reduces tumorigenesis by activating the mouse immune system, or affects tumor bearing animal survival by stimulating the wound repair response, including improved microbiome diversity, in the tumor microenvironment. Provided here is a detailed procedure to assess the effects of environmental enrichment on the biodiversity of the microbiome in a mouse colon tumor model. Precautions regarding animal breeding and considerations for animal genotype and mouse colony integration are described, all of which ultimately affect microbial biodiversity. Heeding these precautions may allow more uniform microbiome transmission, and consequently will alleviate non-treatment dependent effects that can confound study findings. Further, in this procedure, microbiota changes are characterized using 16S rDNA sequencing of DNA isolated from stool collected from the distal colon following long-term environmental enrichment. Gut microbiota imbalance is associated with the pathogenesis of inflammatory bowel disease and colon cancer, but also of obesity and diabetes among others. Importantly, this protocol for EE and microbiome analysis can be utilized to study the role of microbiome pathogenesis across a variety of diseases where robust mouse models exist that can recapitulate human disease.

Environmental Enrichment (EE) is an animal housing environment that is used to reveal mechanisms that underlie the connections between lifestyle, stress, and disease. This protocol describes a procedure that uses a mouse model of colon tumorigenesis and EE to specifically define alterations in microbiota biodiversity that may impact animal mortality.

Un metodo per definire gli effetti dell'arricchimento ambientale sul Colon Microbiome biodiversità in un modello di tumore del Colon del topo

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

Fosfopeptide arricchimento accoppiata alla spettrometria di massa privo di etichetta quantitativa per indagare il Phosphoproteome nel carcinoma della prostata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Reazione a catena della polimerasi digitale per la variazione genetica in un paziente di poliposi adenomatosa familiare sporadica utilizzando il formato di Chip-in-a-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ever-increasing number of studies have identified miRNAs as potential biomarkers for cancer diagnosis and prognosis, and also as therapeutic targets, adding an extra dimension to cancer evaluation and treatment. In the context of thyroid cancer, tumorigenesis results not only from mutations in important genes, but also from the overexpression of many miRNAs. Accordingly, the role of miRNAs in the control of thyroid gene expression is evolving as an important mechanism in cancer. Herein, we present a protocol to examine the effects of miRNA-inhibitor delivery as a therapeutic modality in thyroid cancer using human tumor xenograft and orthotopic mouse models. After engineering stable thyroid tumoral cells expressing GFP and luciferase, cells are injected into nude mice to develop tumors, which can be followed by bioluminescence. The in vivo inhibition of a miRNA can reduce tumor growth and upregulate miRNA gene targets. This method can be used to assess the importance of a determined miRNA in vivo, in addition to identifying new therapeutic targets.

This protocol describes xenograft and orthotopic mouse models of human thyroid tumorigenesis as a platform to test microRNA-based inhibitor treatments. This approach is ideal to study the function of non-coding RNAs and their potential as new therapeutic targets.

In vivivo Inibizione del MicroRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables associated to specific pancreatic pathologies to help preoperative differential diagnosis and patient profiling. Pancreatic juice is a relatively unexplored body fluid, which, due to its close proximity to the tumor site, reflects changes in the surrounding tissue. Here we describe in detail the intraoperative collection procedure. Unfortunately, translating pancreatic juice collection to murine models of PDAC, to perform mechanistic studies, is technically very challenging. Tumor interstitial fluid (TIF) is the extracellular fluid, outside blood and plasma, which bathes tumor and stromal cells. Similarly to pancreatic juice, for its property to collect and concentrate molecules that are found diluted in plasma, TIF can be exploited as an indicator of microenvironmental alterations and as a valuable source of disease-associated biomarkers. Since TIF is not readily accessible, various techniques have been proposed for its isolation. We describe here two simple and technically undemanding methods for its isolation: tissue centrifugation and tissue elution.

Pancreatic juice is a precious source of biomarkers for human pancreatic cancer. We describe here a method for intraoperative collection procedure. To overcome the challenge of adopting this procedure in murine models, we suggest an alternative sample, tumor interstitial fluid, and describe here two protocols for its isolation.

Isolamento di fluidi prossimali per studiare il microambiente tumorale dell'adenocarcinoma pancreatico

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor cells, CAFs regulate tumor progression and provide protection from antitumor immunity. Emerging anticancer strategies aim to remodel the tumor microenvironment through the ablation of pro-tumorigenic CAFs or reprogramming of CAFs functions and their activation status. A promising approach is the development of nanosized delivery agents able to target CAFs, thus allowing the specific delivery of drugs and active molecules. In this context, a cellular model of CAFs may provide a useful tool for in vitro screening and preliminary investigation of such nanoformulations.
This study describes the isolation and culture of primary CAFs from the syngeneic 4T1 murine model of triple-negative breast cancer. Magnetic beads were used in a 2-step separation process to extract CAFs from dissociated tumors. Immunophenotyping control was performed using flow cytometry after each passage to verify the process yield. Isolated CAFs can be employed to study the targeting capability of different nanoformulations designed to tackle the tumor microenvironment. Fluorescently labeled H-ferritin nanocages were used as candidate nanoparticles to set up the method. Nanoparticles, either bare or conjugated with a targeting ligand, were analyzed for their binding to CAFs. The results suggest that ex vivo extraction of breast CAFs may be a useful system to test and validate nanoparticles for the specific targeting of tumorigenic CAFs.

This paper aims to provide a protocol for the isolation and culture of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of triple-negative breast cancer and their application for the preclinical study of novel nanoparticles designed to target the tumor microenvironment.&#160;

Isolamento di fibroblasti primari associati al cancro da un modello murino singeneico di cancro al seno per lo studio di nanoparticelle mirate

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Un modello di fetta di cervello Ex Vivo per studiare e indirizzare la crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...