Yazarlar, Coller laboratuvarının tüm üyelerine yararlı girdiler için teşekkür eder. H.A.C., Rita Allen Vakfı'nın Milton E. Cassel bursiyeriydi. NIH / NCI 1 R01 CA221296-01A1, NIH 1 R01 AR070245-01A1, Melanom Araştırma İttifakı Takım Bilimi Ödülü, Kanser Araştırma Enstitüsü Klinik Laboratuvar Entegrasyon Programı Ödülü, Iris Cantor Kadın Sağlığı Merkezi / UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, California Üniversitesi Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi, David Geffen Tıp Fakültesi Metabolizma Tema Ödülü, Klinik Translasyonel Bilim Enstitüsü ve Jonsson Kapsamlı Kanser Merkezi'ni kabul ediyoruz. Geniş Kök Hücre Araştırma Merkezi'nden (Rose Hills ve Ha Gaba) İnovasyon Ödülleri, Prostat Kanserinde UCLA SPORE'den bir Ödül (P50CA092131 Ödül Numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü), Geniş Kök Hücre Merkezi'nden bir İnovasyon Ödülü, UCLA'daki Eli ve Edythe Geniş Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi'nden bir İnovasyon Ödülü, Tümör Hücresi Biyolojisi Eğitim Programı (USHHS Ruth L. Kirschstein Kurumsal Ulusal Araştırma Hizmeti Ödülü # T32 CA009056), UCLA AR071307'deki Dermatoloji T32 Programı ve UCLA Kas Hücresi Biyolojisi, Patofizyolojisi ve Terapötikleri T32 Eğitim Programı 5 T32 AF 65972.

Açıklanan tüm deneyler, Los Angeles'taki Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.
NOT: Fare suşu için konakçı farelerle eşleşen kanser hücrelerini ve fibroblastları seçin. Konakçı farenin cinsiyetiyle eşleşen kanser hücrelerini ve fibroblastları seçin. Fareleri üreme kolonilerinden alın veya saygın satıcılardan satın alın. Tümörleri ~ 8-10 haftalık farelere tanıtın. Kürklü fareler, saç folikülü döngüsünün telojen veya dinlenme aşamasında olacaktır. Kanser hücresine 0.5 ila 3 fibroblast oranı için plan yapın.
1. Deney için kullanılacak uygun fare sayısını belirleyin
<ol><li>Çalışmaları gerçekleştirmeden önce, çalışmalar için kullanılacak uygun fare sayısını belirlemek için bir güç analizi yapın. Belirtilen güce sahip bir denemenin örnek boyutunu belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın: n = (Z(1-α/2)+Z(1-β)/ES)2 Seçilen anlamlılık düzeyi α ise (genellikle 0,05), 1-α/2 = 0,975 ve Z=1,960. β güçtür ve eğer %80 güç isteniyorsa, o zaman Z=0.84. ES, etki boyutu = \μ1-μ 0\/σ burada μ 0, H0 hipotezi altındaki ortalamadır, μ 1, H1 hipotezi altındaki ortalamadır ve σ, faiz22'nin sonucunun standart sapmasıdır. NOT: Örneklem büyüklüğünün hesaplanması hakkında daha fazla bilgi22 bulunabilir.</li>
</ol>2. Enjeksiyon için kanser hücreleri üretin
<ol><li>Aşağıdaki denklemle ilgili büyüme oranını belirleyin: Gr = (ln (N(t)/N(0)))/t NOT: 24 saat içinde iki katına çıkan hücreler için bir örnek gösterilmiştir İki katına çıkma süresi = ln(2)/büyüme oranı 24 saat = ln(2)/büyüme hızı 24*büyüme oranı = .693 Büyüme hızı = .693/24= .028875</li>
	<li>Plakalanacak kanser hücrelerinin sayısını ve enjeksiyondan önce hücrelerin büyümesi gereken süreyi belirleyin. NOT: Oluşan her tümör için 0.25-1 milyon kanser hücresi enjekte edilir.</li>
	<li>Denkleme göre yeterli sayıda hücre oluşturmak için gereken gün sayısını hesaplayın N(t)=N(0)egr*t burada N(t) t zamanındaki hücre sayısıdır, N(0) 0 zamanındaki hücre sayısıdır, gr büyüme hızıdır ve t zamandır. NOT: 12 tümörün her birine 106 hücre üretmek için 500.000 hücreyi büyütmek için bu hesaplamalara bir örnek. Bu hesaplamalara dayanarak, gerekli sayıda hücreyi büyütmek için 5 gün yeterlidir: N(t)=N(0)egr*t 12 x 106 = 500.000e(gr*t) 12 x 106 = 500.000e (.028875 * t) 24=e(.028875*x) ln(24)=0,028875x 3,178=0,028875x X=110 saat= 4,59 gün Hücrelerin plakaya yapışması ve toplama sırasında kaybolan hücreler için fazladan zaman tanıyın.</li>
	<li>Plaka kanseri hücreleri. NOT: Kültürlü hücrelerle çalışırken eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. NOT: Mikropların havadan numunelere girmesini en aza indirmek için laminer akış başlığında hücre manipülasyonları gerçekleştirin. Doku kültürü başlığını kullanmadan önce ultraviyole ışıkla tedavi edin. Steril teknik ve sadece steril hücre kültürü plastik eşyaları ve doku kültürü ile işlenmiş plakalar, pipetler ve konik tüpler gibi sarf malzemeleri kullanın.<ol><li>Şişedeki hücre sayısına ve kaplandıktan sonra istenen hücre konsantrasyonuna bağlı olarak doku kültürü plakalarının doğru sayısını ve boyutunu hesaplayın.</li>
		<li>Doku kültürü plakalarını etiketleyin.</li>
		<li>37 °C'de suyla bir su banyosu hazırlayın.</li>
		<li>Aliquot ortamını konik tüplere yerleştirin ve 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. Birçok kanser hücresi, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenerek yetiştirilebilir.</li>
		<li>Gerekli sayıda dondurulmuş hücre şişesini sıvı azot dondurucudan çıkarın. NOT: Sıvı nitrojen dondurucudaki hücreleri tutarken dondurucu eldivenleri kullanın.</li>
		<li>Yavaşça sallarken su banyosundaki hücre şişelerini hızla çözün. NOT: Steriliteyi korumak için şişeleri tutarken eldivenlere etanol ekleyin.</li>
		<li>Bir doku kültürü başlığında steril teknik kullanarak, hücreleri 10 mL DMEM +% 10 FBS içeren 15 mL'lik bir konik tüpe pipetin.</li>
		<li>Hücre karışımını 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı steril emme veya steril 10 mL pipet ile yavaşça çıkarın.</li>
		<li>Peletteki hücreleri nazikçe 1 mL DMEM +% 10 FBS'ye yeniden askıya alın.</li>
		<li>Yeniden askıya alınan hücreleri steril bir p1000 ile etiketli bir doku kültürü plakasına pipetin.</li>
		<li>Steril 10 mL pipetler kullanılarak, serum ile doku kültürü plakalarına pipet ortamı.</li>
		<li>Doku kültürü plakalarını 37 °C'de %5 CO2 ile bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Enjeksiyon için yeterli kanser hücresi üretmek için kanser hücrelerini genişletin. NOT: Akıcılık için hücreleri ışık mikroskobu ile izleyin. Her iki ila üç günde bir veya hücrelerin% 100 birleşmeye ulaşmasını önlemek için gerektiğinde tripsinizi yapın. Çok sayıda hücre gerekiyorsa, çok sayıda hücreyi alan ve orta verimli bir şekilde büyütmek için hiperşişeler (Malzeme Tablosu) kullanın. Hücrelerin her geçirilmesi gerektiğinde, şu prosedürü izleyin:<ol><li>Ortamı steril emme veya steril 10 mL pipet ile plakadan çıkarın.</li>
		<li>Sıcak fosfat tamponlu salin (PBS) üzerine pipetleyerek plakayı nazikçe yıkayın. Ardından PBS'yi steril emme veya pipet ile çıkarın.</li>
		<li>PBS'de 5 mL 1x Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 'yi 10 cm'lik bir plaka için hücrelere pipet edin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Hücreleri plakadan çıkarmak için nazik dokunuşlarla plakadan hücreleri çıkarın.</li>
		<li>Steril 10 mL pipet kullanarak, hücreleri konik tüplerde% 10 FBS serumu ile DMEM'e toplayın.</li>
		<li>Konik tüpleri 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
		<li>Süpernatantı dökerek çıkarın. Hücre peleti görünür olmalıdır. Tüpün içinde kaldığından emin olmak için izleyin.</li>
		<li>Peletlenmiş hücreleri 1 mL DMEM + %10 FBS ekleyerek ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın.</li>
		<li>Aliquot hücreleri DMEM +% 10 FBS ile uygun boyuttaki yeni doku kültürü plakalarına yeniden askıya alır (10 mL'lik bir ortam, 10 cm'lik bir doku kültürü plakası için uygundur).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Enjeksiyon için fibroblastlar üretin
NOT: Primer fibroblastlar çok fazla iki katına çıktıktan / pasajdan sonra yaşlanacaktır. Primer fibroblastların sınırlı sayıda pasajdan veya iki katına çıkmadan sonra kullanılması önemlidir. Fibroblastların fare veya insan derisinden büyüdüğü geçiş veya iki katına çıkma sayısını takip edin. Primer insan dermal fibroblastları için 15'ten az pasajı olan fibroblastları kullanın. Fare embriyonik fibroblastları için 9'dan az pasajlı fibroblastlar kullanın. Fibroblastlar birleştiklerinde değişirler. Fibroblastları yaklaşık% 90 birleştiklerinde tripsizleştirin. Fibroblastlar, nasıl kültürlendiklerine bağlı olarak farklı özelliklere sahip olacaktır. Birçok bilim adamı, doku benzeri ortamları daha etkili bir şekilde yakalayan 3D kollajen matrisleri gibi doku kültürü plakalarından daha fizyolojik olarak ilgili substratlar üzerinde kültürlemeyi teşvik eder23,24,25.
<ol><li>Fibroblast hücrelerinin büyüme hızını belirlemek için bölüm 2.1'deki denklemi kullanın.</li>
	<li>Fibroblastları genişletmek için gereken gün sayısını belirlemek için bölüm 2.2'deki denklemi kullanın.</li>
	<li>Fibroblastları, kanser hücrelerinin ve fibroblastların aynı gün enjeksiyona hazır olmasını sağlamak için uygun günde uygun ortamı kullanarak bölüm 2.3'te açıklandığı gibi plakalayın.</li>
	<li>Bölüm 2.4'te açıklanan prosedürleri takiben gerekli olan yeterli sayıda fibroblast üretmek için fibroblastları uygun ortamda genişletin.</li>
</ol>4. Enjeksiyon için fareleri hazırlamak için fareleri tıraş edin
NOT: Farelerle çalışırken laboratuvar önlükleri, saç ağları, ayakkabı kılıfları ve eldivenler giyin.
<ol><li>Enjeksiyondan bir ila iki gün önce, Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi kurallarına uygun olarak, fareleri uyuşturun. Anestezi için izofluran kullanıyorsanız, izofluran veO2 karışımı kullanın. Fareleri bir anestezi odasına yerleştirin ve anesteziyi indüklemek için bir izofluran (% 5) /O2 karışımı ekleyin. Daha sonra, anestezinin cerrahi düzlemini sabit bir izofluran (% 2) / O2 karışımı akışıyla korumak için burun konisini anestezi altındaki hayvanın üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Farenin ayak parmağını sıkıştırarak ve farenin hareket etmediğini doğrulayarak uygun cerrahi anestezi düzleminde olduklarından emin olmak için hayvanları kontrol edin.</li>
	<li>Cerrahi bıçak # 40 ile bir hayvan kesme makinesi kullanarak, kürk çıkarılana kadar hayvan kesme makinesini cildin üzerinden birkaç kez geçirerek kürkü farelerin yanlarındaki uygun konumlardan yavaşça çıkarın.</li>
	<li>Anesteziden iyileşene kadar fareleri izleyin.</li>
</ol>5. Kanser hücrelerini ve fibroblastları enjeksiyon için hazırlayın
NOT: Kanser hücreleri ve fibroblastlar toplandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede, tercihen 30 dakika içinde enjekte edilmelidir. Enjeksiyon sabahında, kanser hücrelerini ve fibroblastları doku kültürü plakalarından ayrı olarak toplayın. Her hücre türü için aşağıdaki adımları gerçekleştirin:
<ol><li>Ortamı doku kültürü plakasından nazik steril emme ile veya ortamdan pipetleyerek çıkarın.</li>
	<li>Hücreleri bozmadan 5 mL PBS üzerine nazikçe pipetin. PBS'yi döndürün. PBS'yi emme veya pipetle PBS'den nazikçe aspire edin.</li>
	<li>PBS'deki 5 mL Tripsin-EDTA'yı hücre tabakasına nazikçe pipetleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri yerinden çıkarmak için hafif dokunuşlarla plakadan hücreleri çıkarın. Hücreleri 10 mL'lik bir pipet ile birkaç kez pipet edin ve hücreleri% 10 FBS ile DMEM içeren konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Konik tüpleri 180 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı yavaşça dökerek çıkarın, hücre topağını koruyun. Hücre peletini PBS ile iki kez yıkayın. Her seferinde, hücrelere 10 mL PBS pipetleyin. Bir p1000 pipet ile yavaşça karıştırın.</li>
	<li>Hücreleri adım 5.5'teki gibi santrifüj edin. PBS'yi bir pipetle yavaşça çıkarın ve tekrarlayın.</li>
	<li>Yıkanmış, peletlenmiş hücreleri 1 mL PBS'de bir p1000 ile yeniden askıya alın.</li>
	<li>Bir hemositometre slaytını alkolle temizleyin ve kurutun.</li>
	<li>Hücre karışımının 100 μL'sini bir tüpe pipet edin ve% 0.32'lik nihai bir Tripan mavisi konsantrasyonu için 400 μL% 0.4 Tripan mavisi ekleyin.</li>
	<li>Hücre karışımını oda dolana kadar pipetleyerek kapak kapağının altındaki cam hemositometrenin odalarını nazikçe doldurun.</li>
	<li>Bir mikroskop kullanarak, 10x hedefin ızgara çizgilerine odaklanın.</li>
	<li>Canlı, lekesiz hücreleri ve mavi hücreleri 16 karelik bir kümede sayın.</li>
	<li>16 karelik 4 setin tümünü sayın.</li>
	<li>16 kareden oluşan 4 kümeden berrak ve mavi hücreler için hücre sayısının ortalamasını alın ve 10.000 ile çarpın. Tripan mavisinden 1:5 seyreltmeyi düzeltmek için 5 ile çarpın.</li>
	<li>Son sayımlar, canlı ve ölü hücreler için hücrelerdeki konsantrasyon / mL'dir. Toplam kanser hücresi ve fibroblast sayısını belirlemek için hacimle çarpın. Canlı olan hücrelerin fraksiyonunun% >80 olduğunu doğrulayın.</li>
	<li>Planlanan tüm enjeksiyonlar için yeterli sayıda melanom hücresi ve fibroblast olduğunu onaylayın, enjeksiyonlar sırasında en az% 20 örnek kaybı olduğunu varsayarsak.</li>
	<li>Gerekli sayıda hücreyi yeni bir konik tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile pelet edin (5 dakika boyunca 180 x g).</li>
	<li>Süpernatantı 10 mL'lik bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Peletin gerekli konsantrasyonda uygun miktarda Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) GRADE PBS (intradermal enjeksiyon için tümör başına 50 μL ve deri altı enjeksiyonu için tümör başına 100 μL) içinde tekrar askıya alınması.</li>
</ol>6. Kanser hücrelerini ve fibroblastları farelere enjekte edin
NOT: Kurumsal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanırsa, her fareye, her bir kanatta bir tane olmak üzere iki tümör enjekte edin. Hangi farenin sağ ve sol kanatlarda hangi enjeksiyonu alacağını rastgele belirleyin. Enjekte edilecek fare sayısına bağlı olarak, fareleri uyuşturun ve kanser hücrelerini ve fibroblastları farelere gruplar halinde enjekte edin.
<ol><li>Kanser hücrelerinin deri altı enjeksiyonu için<ol><li>Fareleri bölüm 4.1'de açıklandığı gibi uyuşturun.</li>
		<li>Tıraş olmuş cildi alkollü çubuklarla silin.</li>
		<li>Steril bir şırıngayı istenen miktarda hücre veya hücre karışımı ile doldurun ve şırıngayı 27 gauge iğne ile kapatın. NOT: Hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı gerektiği gibi hareket ettirin. Hücreler şırıngaya sokulduktan sonra, kümelenmeyi önlemek için şırıngaları sürekli olarak ters çevirerek şırıngaların içindeki hücreleri iyi karıştırılmış halde tutun.</li>
		<li>İğneyi farenin yan tarafındaki deri altı bölgesine yerleştirin ve hücreleri yavaşça fareye enjekte edin. Subkutan enjeksiyon için tümör başına 100 μL hücre süspansiyonu kullanın (enjeksiyon başına 100 μL'den fazla hacim kullanılması önerilmez).</li>
		<li>Anesteziden iyileşene kadar fareleri izleyin. Gerekirse, farelerin tamamen iyileşmesine yardımcı olmak için farelere kulübeler ve / veya ısıtma pedleri gibi ekstra yalıtım malzemeleri sağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kanser hücrelerinin intradermal enjeksiyonları için<ol><li>Fareleri bölüm 4.1'de açıklandığı gibi uyuşturun.</li>
		<li>Tıraş olmuş cildi alkollü çubuklarla silin.</li>
		<li>Steril bir şırıngayı istenen miktarda hücre veya hücre karışımı ile doldurun ve şırıngayı 27 gauge iğne ile kapatın. NOT: Hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı gerektiği gibi hareket ettirin. Hücreler şırıngaya sokulduktan sonra, kümelenmeyi önlemek için şırıngaları sürekli olarak ters çevirerek şırıngaların içindeki hücreleri iyi karıştırılmış halde tutun.</li>
		<li>Farenin yan tarafındaki cildin intradermal bölgesine 27 gauge bir iğne yerleştirin ve hücreleri faredeki intradermal bölgeye yavaşça enjekte edin. İntradermal enjeksiyon için tümör başına 50μL hücre süspansiyonu kullanın (enjeksiyon başına 50 μL'den fazla hacim kullanılması önerilmez).</li>
		<li>Anesteziden iyileşene kadar fareleri izleyin. Farelerin sıkıntıda olduğuna dair işaretler varsa, bir veterinere danışın. Gerekirse, farelerin tamamen iyileşmesine yardımcı olmak için farelere kulübeler ve / veya ısıtma pedleri gibi ekstra yalıtım malzemeleri sağlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Tümör büyümesi sırasında fareleri izleyin
<ol><li>Fareleri herhangi bir ağrı veya sıkıntı belirtisi (kambur duruş, kıvranma, seslendirme, kafes boyunca uzanma, karınlarını kafes tabanının dibine bastırma veya kafesin etrafında hareket etme isteksizliği) veya apse oluşumu için günlük olarak izleyin. Farelerin sıkıntıda olduğuna dair işaretler varsa, bir veterinere danışın.</li>
	<li>Tümörler oluştuktan sonra, tümör hacmini yaklaşık iki ila üç günde bir ölçün. Kaliperlerle tümör uzunluğunu (en uzun taraf) ve genişliği (uzunluğa dikey) ölçün. NOT: En iyi uygulamalar, verilerdeki değişkenliği azaltmak için aynı kişinin deney boyunca bu ölçümleri gerçekleştirmesidir. Ölçümler için, fareleri bölüm 4.1'de açıklandığı gibi uyuşturun</li>
	<li>Tümör hacimlerini Hacim = 0.5 x (Uzunluk x Genişlik2) formülüyle hesaplayın.</li>
</ol>8. Tümörleri toplayın ve tümör ağırlıklarını ölçün
<ol><li>Tümör büyümesi kurum Hayvan Bakımı Komitesi tarafından kurulan deneysel bir son noktaya ulaştığında fareleri ötenazi yapın. Fareleri bir odaya yerleştirin ve solunumun kesilmesinden bir dakika sonra basınçlı CO2 ile oda havasının yavaş (dakikada% 20-30) yer değiştirmesiyle ötenazi yapın.</li>
	<li>Farelerde servikal çıkık gerçekleştirin. Kemirgenleri sert, düz bir yüzeyde tutun. Kafatasının tabanındaki boynun arkasına sağlam bir kalem veya başka bir nesne yerleştirin. Kuyruğun tabanını tutan el ile geriye doğru çekerken nesne kafayı kısıtlayarak hızlı bir şekilde ileri ve aşağı itin. Palpasyonla omuriliğin koptuğunu onaylayın. NOT: Servikal çıkık deneyimli laboratuvar personeli tarafından yapılmalıdır.</li>
	<li>Deneydeki her fare için, nefes alma, kalp atışı ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt olmadığını kontrol ederek farenin artık hayatta olmadığını doğrulayın.</li>
	<li>Steril bir neşter ve cerrahi makas kullanarak, tüm tümörü fareden çıkarın. Cerrahi makas ile, tümör olmayan dokuyu tümörden kesin.</li>
	<li>Tümörü analitik bir terazide tartın ve tümör ağırlığını kaydedin.</li>
</ol>9. Tümör hacimlerinin ve tümör ağırlıklarının istatistiksel analizi
<ol><li>Her gruptaki tümör hacimlerini tekrarlanan ölçümlerle varyans analizi (ANOVA) ile karşılaştırın. Fare başına iki tümör enjekte edilmişse eşleştirilmiş analiz yapın.</li>
	<li>İki kuyruklu bir test kullanarak ANOVA ile gruplar arasındaki tümör ağırlıklarını karşılaştırın. Tukey'in post-hoc testi daha sonra hangi grupların birbirinden önemli ölçüde farklı olduğunu belirlemek için kullanılabilir. Fare başına iki tümör enjekte edilmişse eşleştirilmiş analiz yapın.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Şekil 1'deki deneyde, insan dermal fibroblastlarının insan A2058 melanom hücreleri ile birlikte tanıtılması, melanom hücrelerinin birlikte enjekte edilen fibroblastlar olmadan tanıtıldığından daha büyük tümörlerle sonuçlandı. Bu fark, tümör hacmine ve tümör ağırlığına bağlı olarak kolayca tespit edilebilir. Sonuçlar, kanserle ilişkili fibroblastların tümör büyümesini destekleyebileceğine dair birçok raporla tutarlıdır5,6,7,8<su...

Tümör mikroçevresinde, en belirgin hücre tiplerinden biri kanserle ilişkili fibroblasttır (CAF)1. Bu karsinomla ilişkili fibroblastlar tümör baskılayıcı bir rol oynayabilir 2,3. Örneğin, S100A eksprese eden fibroblastlar, kanserojenleri kapsülleyebilen ve karsinom oluşumuna karşı koruma sağlayabilen kollajenleri salgılar4. Ayrıca, pankreas kanserinde α-düz kas aktini (SMA) pozitif miyofibroblastların tükenmesi immünsüpresyona neden olur ve pankreas kanseri ilerlemesini hızlandırır2. CAF'lar ayrıca kanser hücreleri ile birlikte gelişebilir ve tümör ilerlemesini teşvik edebilir 5,6,7,8. Fibroblastlar, tümörü teşvik eden bir ortam yaratan hücre dışı matriks proteinlerini sentezleyebilir ve salgılayabilir8. Bu hücre dışı matriks proteinleri, tümör ilerlemesi ile ilişkili olan dokunun mekanik sertleşmesine neden olabilir 9,10. Biriken hücre dışı matriks, bağışıklık infiltrasyonunu inhibe eden fiziksel bir bariyer görevi görebilir11. CAF'lar tarafından matriks birikimi de tümör invazyonu ile ilişkilendirilmiştir, çünkü CAF'lar tarafından üretilen fibronektinin tümör invazyonunu teşvik ettiği gösterilmiştir12. CAF'lar anjiyogenezi teşvik eder ve dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), interlökin-6 (IL-6) ve CXC-kemokin ligand 12 (CXCL12)13,14,15 salgılayarak immünosüpresif hücreleri tümör mikroçevresine alır. Tümör büyümesini teşvik etmedeki merkezi rolleri nedeniyle, kanserle ilişkili fibroblastlar anti-kanser tedavisi için ortaya çıkan bir hedeftir 6,16,17,18.
Aşağıdaki protokol, fibroblastların tümör büyümesinin iyi kurulmuş ve yaygın olarak kullanılan bir fare modelinde tümörlerin büyümesini nasıl etkilediğini test etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Fibroblastların tümör mikroortamındaki önemini anlamak için, büyümelerini izlemek için kanser hücrelerini farelere sokmak için standart protokol, kanser hücresi girişi ile fibroblastları içerecek şekilde değiştirildi. Kanser hücreleri deri altından veya intradermal olarak sokulabilir. İntradermal giriş, cildin kendisinden kaynaklanan tümörlerle sonuçlanır. Kanser hücrelerinin ve fibroblastların farelere birlikte enjekte edildiği ksenogreftler, fibroblastların, fibroblastların alt popülasyonlarının ve protein faktörlerinin kanser büyümesini teşvik etme yeteneğindeki rolünü incelemek için önemli bir metodolojik araçtır 19,20,21. Kanser hücrelerinin ve fibroblastların farelere birlikte enjeksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu yöntem, fibroblastların varlığını veya yokluğunu karşılaştırmak, farklı kaynaklardan fibroblastları karşılaştırmak içinkullanılabilir 20 veya fibroblastları spesifik proteinlerin ekspresyonu olan ve olmayan fibroblastları karşılaştırmakiçin 19. Kanser hücreleri ve fibroblastlar tanıtıldıktan sonra, zamanla tümör boyutu izlenebilir. Deneylerin sonunda, tümörler diseke edilebilir ve tartılabilir. Zaman içinde tümör büyümesi izlenerek, farklı faktörlerin önemi diseke edilebilir.
Fibroblastların tümör büyümesindeki rolünü incelemek için olası alternatif yaklaşımlar vardır. Örnek olarak, fibroblastlarda tercihen ifade edilen sürücülerle genlerin dokuya özgü nakavtını sağlayan Cre-loxed tabanlı modeller vardır. Bu tür yaklaşımlar ayrıca tümör progresyonu için fibroblastlarda spesifik genlerin ve yolakların rolünü araştırmak için fırsatlar sağlar. Cre-lox tabanlı yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, sağlanan protokol, fibroblastların rolünü izlemek için önemli ölçüde daha hızlı bir yaklaşımı temsil edecektir, çünkü tümör büyümesi sadece birkaç hafta içinde izlenecektir. Sağlanan yaklaşım aynı zamanda önemli ölçüde daha ucuzdur, çünkü genetiği değiştirilmiş farelerin kolonilerinin üretilmesini ve barındırılmasını gerektirmez. Sağlanan protokol, fare kolonileri geliştirmeye ihtiyaç duymak yerine shRNA'lar kullanarak farklı genlerin yıkılmasının etkisini hızlı bir şekilde test etmek için kullanılabilir. Sağlanan yaklaşım aynı zamanda daha esnektir, çünkü farklı sayıda fibroblastın, farklı kanser hücrelerinin ve fibroblastların farklı oranlarının, farklı genlerin yıkılmasına ve hatta farklı doku bölgelerinden veya türlerden fibroblastların karşılaştırılmasına izin verecektir. Bir Cre-lox yaklaşımı, fibroblastların farelerde daha fizyolojik bir bağlamda bulunması avantajına sahip olacaktır.
Burada bildirilen protokol, fibroblastların tümör büyümesi üzerindeki etkilerini hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde izlemek isteyen bilim adamları için değerli olacaktır. Bu protokol, tümör büyümesi üzerine tümör büyümesi üzerine farklı kaynaklardan fibroblastların veya fibroblastların farklı alt kümelerini araştıran bilim adamları için özellikle değerlidir. Tümör başlangıcının fizyolojik bir bağlamda gerçekleşmesi önemliyse, genetik olarak tasarlanmış fare modelleri düşünülmelidir.
Bu deneyleri gerçekleştirmek için birkaç olası yaklaşım vardır. Bağışıklık yetkin fareler, fibroblast-immün hücre etkileşimlerinin araştırılmasına izin verecek konakçı olarak kullanılabilir. Bağışıklık yetkin fare modelleri için, fare kanseri hücreleri ve fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) enjekte edilmelidir. MEF'lerin kullanımı ayrıca, araştırmacının, ilgilendiği bir genin varlığını veya yokluğunu test etmek için çok çeşitli nakavt fare suşlarından yararlanmasına izin verir. Alternatif olarak, bağışıklık yetersizliği olan fareler, insan kanser hücrelerinden türetilen farelerde tümörlerin büyümesini teşvik etmede insan fibroblastlarının rolünü test etmek için kullanılabilir. Kanser hücrelerinin tanıtımı deri altından veya ortotopik olarak yapılabilir. Melanom için, aşağıda tarif edildiği gibi, tümör-fibroblast karışımı, bir melanomun gelişeceği cilt içindeki yeri daha yakından simüle eden ortotopik enjeksiyon için intradermal olarak enjekte edilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>26G Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal clipper miniARCO with surgical blade #40</td>
			<td>WAHL Professional</td>
			<td>8787-450A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Athymic nude mice (NU/J)</td>
			<td>The Jackson labs</td>
			<td>002019</td>
			<td>These mice are immunocompromised and can be used for experiments in which human cells are introduced. Immunocompetent mice can also be used if mouse cancer cells and fibroblasts will be introduced.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174; CRL-11147&#8482;</td>
			<td>This is the catalog number for a primary human melanoma cell line. Other cancer cell types can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multi Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for conical tubes capable of reaching 180 x g</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblasts&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>We isolate fibroblasts from skin in our lab. This is a catalog number for an adult primary human dermal fibroblast cell line. MEFs and fibroblasts derived from other sites can also be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS USP grade for injection into mice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667210B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 5 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters pore size 0.2 microns</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-740-61A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue culture-grade Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile tissue-culture grade PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-751-7476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterle 25 ml serological pipet</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>667225B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 100 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 150 x 20 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC treated 60 x 15 mm dishes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a mouse model to investigate the role of cancer-associated fibroblasts in tumor growth

Kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF'ler), tümörü teşvik eden bir mikro çevre oluşturarak tümör büyümesinde önemli bir rol oynayabilir. CAF'ların tümör mikroortamındaki rolünü inceleyen modeller, fibroblastların, farklı dokulardan fibroblastların ve fibroblastlardaki spesifik genetik faktörlerin fonksiyonel önemini anlamak için yararlı olabilir. Fare modelleri, in vivo bağlamda tümör büyümesine ve ilerlemesine katkıda bulunanları anlamak için gereklidir. Burada, kanser hücrelerinin fibroblastlarla karıştırıldığı ve tümör geliştirmek için farelere verildiği bir protokol sağlanır. Zaman içindeki tümör boyutları ve nihai tümör ağırlıkları belirlenir ve gruplar arasında karşılaştırılır. Açıklanan protokol, CAF'ların tümör büyümesi ve ilerlemesindeki fonksiyonel rolü hakkında daha fazla bilgi sağlayabilir.

A2058 insan melanom hücreleri ve primer insan dermal fibroblastları steril koşullar altında kültürlendi. Hücreler toplandı ve PBS ile üç kez yıkandı. İmmün yetmezlikli fareler (NU / J - Foxn1 çıplak suşu), yalnızca 0.25 milyon A2058 melanom hücresi ile bir kanatta deri altından enjekte edildi. Diğer kanatta, farelere 0.25 milyon A2058 melanom hücresi ve 0.75 milyon fibroblast karışımı enjekte edildi. Hücreler, bağışıklık yetmezliği olan 12 fareye enjekte e...

Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth at JoVE.com

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Kanser hücrelerini ve fibroblastları birlikte enjekte etmek ve zamanla tümör büyümesini izlemek için bir protokol sağlanır. Bu protokol, fibroblastların tümör büyümesinin düzenleyicileri olarak rolünün moleküler temelini anlamak için kullanılabilir.

Kanserle İlişkili Fibroblastların Tümör Büyümesindeki Rolünü Araştırmak İçin Bir Fare Modeli

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

a-mouse-model-to-investigate-role-cancer-associated-fibroblasts-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

4.3K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Kanser hücrelerini ve fibroblastları birlikte enjekte etmek ve zamanla tümör büyümesini izlemek için bir protokol sağlanır. Bu protokol, fibroblastların tümör büyümesinin düzenleyicileri olarak rolünün moleküler temelini anlamak için kullanılabilir.

Video: A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Tümör Engraftment insan Mantle hücreli lenfoma, Xenograft fare modeli

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Kanser Araştırmaları

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental enrichment (EE) reduces tumorigenesis by activating the mouse immune system, or affects tumor bearing animal survival by stimulating the wound repair response, including improved microbiome diversity, in the tumor microenvironment. Provided here is a detailed procedure to assess the effects of environmental enrichment on the biodiversity of the microbiome in a mouse colon tumor model. Precautions regarding animal breeding and considerations for animal genotype and mouse colony integration are described, all of which ultimately affect microbial biodiversity. Heeding these precautions may allow more uniform microbiome transmission, and consequently will alleviate non-treatment dependent effects that can confound study findings. Further, in this procedure, microbiota changes are characterized using 16S rDNA sequencing of DNA isolated from stool collected from the distal colon following long-term environmental enrichment. Gut microbiota imbalance is associated with the pathogenesis of inflammatory bowel disease and colon cancer, but also of obesity and diabetes among others. Importantly, this protocol for EE and microbiome analysis can be utilized to study the role of microbiome pathogenesis across a variety of diseases where robust mouse models exist that can recapitulate human disease.

Environmental Enrichment (EE) is an animal housing environment that is used to reveal mechanisms that underlie the connections between lifestyle, stress, and disease. This protocol describes a procedure that uses a mouse model of colon tumorigenesis and EE to specifically define alterations in microbiota biodiversity that may impact animal mortality.

Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ever-increasing number of studies have identified miRNAs as potential biomarkers for cancer diagnosis and prognosis, and also as therapeutic targets, adding an extra dimension to cancer evaluation and treatment. In the context of thyroid cancer, tumorigenesis results not only from mutations in important genes, but also from the overexpression of many miRNAs. Accordingly, the role of miRNAs in the control of thyroid gene expression is evolving as an important mechanism in cancer. Herein, we present a protocol to examine the effects of miRNA-inhibitor delivery as a therapeutic modality in thyroid cancer using human tumor xenograft and orthotopic mouse models. After engineering stable thyroid tumoral cells expressing GFP and luciferase, cells are injected into nude mice to develop tumors, which can be followed by bioluminescence. The in vivo inhibition of a miRNA can reduce tumor growth and upregulate miRNA gene targets. This method can be used to assess the importance of a determined miRNA in vivo, in addition to identifying new therapeutic targets.

This protocol describes xenograft and orthotopic mouse models of human thyroid tumorigenesis as a platform to test microRNA-based inhibitor treatments. This approach is ideal to study the function of non-coding RNAs and their potential as new therapeutic targets.

Farelerde Tümör Büyümesini Azaltmak için MikroRNA'nın Vivo İnhibisyonu

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables associated to specific pancreatic pathologies to help preoperative differential diagnosis and patient profiling. Pancreatic juice is a relatively unexplored body fluid, which, due to its close proximity to the tumor site, reflects changes in the surrounding tissue. Here we describe in detail the intraoperative collection procedure. Unfortunately, translating pancreatic juice collection to murine models of PDAC, to perform mechanistic studies, is technically very challenging. Tumor interstitial fluid (TIF) is the extracellular fluid, outside blood and plasma, which bathes tumor and stromal cells. Similarly to pancreatic juice, for its property to collect and concentrate molecules that are found diluted in plasma, TIF can be exploited as an indicator of microenvironmental alterations and as a valuable source of disease-associated biomarkers. Since TIF is not readily accessible, various techniques have been proposed for its isolation. We describe here two simple and technically undemanding methods for its isolation: tissue centrifugation and tissue elution.

Pancreatic juice is a precious source of biomarkers for human pancreatic cancer. We describe here a method for intraoperative collection procedure. To overcome the challenge of adopting this procedure in murine models, we suggest an alternative sample, tumor interstitial fluid, and describe here two protocols for its isolation.

Pankreatik adenokarsinomun tümör mikroçevresini araştırmak için proksimal sıvıların izolasyonu

Pancreatic adenocarcinoma (PDAC) is the fourth leading cause of cancer-related death, and soon to become the second. There is an urgent need of variables ...

Isolation of Primary Cancer-Associated Fibroblasts from a Syngeneic Murine Model of Breast Cancer for the Study of Targeted Nanoparticles

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor cells, CAFs regulate tumor progression and provide protection from antitumor immunity. Emerging anticancer strategies aim to remodel the tumor microenvironment through the ablation of pro-tumorigenic CAFs or reprogramming of CAFs functions and their activation status. A promising approach is the development of nanosized delivery agents able to target CAFs, thus allowing the specific delivery of drugs and active molecules. In this context, a cellular model of CAFs may provide a useful tool for in vitro screening and preliminary investigation of such nanoformulations.
This study describes the isolation and culture of primary CAFs from the syngeneic 4T1 murine model of triple-negative breast cancer. Magnetic beads were used in a 2-step separation process to extract CAFs from dissociated tumors. Immunophenotyping control was performed using flow cytometry after each passage to verify the process yield. Isolated CAFs can be employed to study the targeting capability of different nanoformulations designed to tackle the tumor microenvironment. Fluorescently labeled H-ferritin nanocages were used as candidate nanoparticles to set up the method. Nanoparticles, either bare or conjugated with a targeting ligand, were analyzed for their binding to CAFs. The results suggest that ex vivo extraction of breast CAFs may be a useful system to test and validate nanoparticles for the specific targeting of tumorigenic CAFs.

This paper aims to provide a protocol for the isolation and culture of primary cancer-associated fibroblasts from a syngeneic murine model of triple-negative breast cancer and their application for the preclinical study of novel nanoparticles designed to target the tumor microenvironment.&#160;

Hedeflenen Nanopartiküllerin Çalışması için Meme Kanserinin Singeneik Murine Modelinden Primer Kanserle İlişkili Fibroblastların İzolasyonu

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are key actors in the context of the tumor microenvironment. Despite being reduced in number as compared to tumor ...

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical outcomes. Preclinical mouse models of breast cancer brain metastatic (BCBM) growth are useful but are expensive, and it is difficult to track live cells and tumor cell invasion within the brain parenchyma. Presented here is a protocol for ex vivo brain slice cultures from xenografted mice containing intracranially injected breast cancer brain-seeking clonal sublines. MDA-MB-231BR luciferase tagged cells were injected intracranially into the brains of Nu/Nu female mice, and following tumor formation, the brains were isolated, sliced, and cultured ex vivo. The tumor slices were imaged to identify tumor cells expressing luciferase and monitor their proliferation and invasion in the brain parenchyma for up to 10 days. Further, the protocol describes the use of time-lapse microscopy to image the growth and invasive behavior of the tumor cells following treatment with ionizing radiation or chemotherapy. The response of tumor cells to treatments can be visualized by live-imaging microscopy, measuring bioluminescence intensity, and performing histology on the brain slice containing BCBM cells. Thus, this ex vivo slice model may be a useful platform for rapid testing of novel therapeutic agents alone or in combination with radiation to identify drugs personalized to target an individual patient&#39;s breast cancer brain metastatic growth within the brain microenvironment.

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

We introduce a protocol for measuring real-time drug and radiation response of breast cancer brain metastatic cells in an organotypic brain slice model. The methods provide a quantitative assay to investigate the therapeutic effects of various treatments on brain metastases from breast cancer in an ex vivo manner within the brain microenvironment interface.

Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...