Nosso protocolo para alta produtividade, células de levedura permite o rastreamento do crescimento e expressão genética para milhares de microcolônias simultaneamente. A diferença entre as cepas, entre ambientes e até mesmo entre células geneticamente idênticas cultivadas em um ambiente compartilhado pode ser quantificada. O protocolo produz estimativas precisas da taxa média de crescimento e intensidade média de fluorescência dos repórteres de expressão genética.
Além disso, como muitas microcolônias individuais são avaliadas, são obtidas estimativas precisas de distribuições inteiras de valores de crescimento e expressão. Este protocolo segue dois passos principais, a preparação da placa experimental e a preparação das células para imagem. As células devem ser banhadas imediatamente após a diluição e a mistura.
Por isso, recomendamos configurar sua placa experimental primeiro. Você notará a repetida mistura de células ao longo deste protocolo, que é extremamente importante nos passos até o revestimento. No dia do experimento, todas as mídias e outras soluções utilizadas para o ensaio devem ser filtradas com um filtro de dois mícrons, mesmo que já estejam estéreis, a fim de remover quaisquer cristais que possam aparecer em imagens de microscópio.
Isso inclui mídia experimental e a solução Concanavalin A. Em seguida, prepare a placa do microscópio. Para manter a superfície de vidro dos poços livre de detritos e arranhões, mantenha sempre um fiapo e lenço livre estático sob a placa.
Use técnica estéril em um banco esterilizado. Filtrar 25 mililitros de 1X Concanavalina Uma solução e pipeta 200 microlitros em cada poço da placa de microscópio. Recomendamos estabilizar a pipeta para garantir a altura adequada.
Centrifugar a placa do microscópio com um fiapo e limpar livremente estática por baixo por dois minutos a 411 vezes G, a fim de remover quaisquer bolhas de ar que poderiam impedir concanavalina A de revestir uniformemente a parte inferior dos poços. Deixe a placa contendo a Solução Concanavalina Uma solução descansar por uma a duas horas. Seja consistente em seus experimentos.
Após a incubação Concanavalin A, limpe o Concanavalin A da placa do poço 96, seja com um dispositivo de sucção ou despejando a solução à força da placa, como mostrado aqui. Algumas gotículas permanecerão. Em seguida, lave os poços adicionando 400 microliters de água estéril a cada poço.
Adicione a água imediatamente após a remoção da solução Concanavalina A. Não deixe o prato ficar seco. É importante evitar tocar na parte inferior revestida da placa com as pontas da pipeta para não deslocar ou remover Concanavalina A da superfície de vidro dos poços.
Remova a água da mesma forma que a solução Concanavalin A e adicione imediatamente 185 microlitros de mídia experimental à sua placa de microscópio. Não deixe a placa ficar seca. A placa está pronta para a adição de 50 microliters de células diluídas.
Recupere sua placa de 96 poços randomizada pré-cultivada. Sua pergunta experimental determinará se as células estão saturadas ou em fase de registro e o número de réplicas aleatórias que devem ser usadas no ensaio. Centrifugar a placa por dois minutos a 411 vezes G para minimizar a chance de contaminação cruzada ao remover a cobertura da folha.
Certifique-se de nunca inclinar seu prato quando você estiver manuseando-o. Se a levedura e a mídia entrarem em contato com a folha que cobre a placa, pode haver contaminação em poços. Primeiro prepare as placas em que conduzirá suas diluições seriais.
Adicione 90 microliters de mídia experimental a cada uma de suas placas de diluição. Em seguida, preparem suas células. Tenha muito cuidado ao remover a folha da placa de 96 poços para evitar que gotículas de um poço entrem em outro.
A levedura estará concentrada na parte inferior da placa devido à centrifugação. Para garantir que as células estejam bem misturadas durante a sua diluição, adicione sempre um pequeno volume de células a um volume maior de mídia. Em seguida, adicione outro grande volume de mídia à mistura.
Certifique-se de misturar a pipeta vigorosamente a cada passo. Neste vídeo, realizamos diluições para células de levedura em saturação e mídia completa sintética, que vamos diluir 10.000 vezes para alcançar uma concentração final de cerca de 4.000 células por poço na placa de microscópio. Para suspender as células, pipeta para cima e para baixo vigorosamente e mover a ponta da pipeta ao redor do poço em um movimento circular.
Após a mistura, não deve haver vestígios de leveduras assentadas permanecendo em qualquer bem como visto aqui em bem A1. Todos os outros poços aqui mostrados não foram rein suspendidos para comparação. Conte as células em sua placa pré-cultivada, por exemplo, com o hemótmetro, e combine com qualquer outra cepa que você adicionará ao mesmo poço em proporções iguais. Aqui, misturamos as células da nossa placa pré-cultivada com uma cepa de referência fluorescente em uma proporção de um para um.
Uma vez que suas concentrações celulares são padronizadas, adicione dez microliters de células à primeira placa de diluição serial. Em seguida, adicione 100 microliters de mídia a um volume final de 200 microliters. Com a adição de células e mídia, a pipeta se mistura vigorosamente, movendo a ponta da pipeta ao redor dos poços em um movimento circular.
A partir deste ponto, até que as células sejam adicionadas à placa de microscópio, prossiga rapidamente através do protocolo. Em seguida, adicione dez microliters de levedura da primeira placa de diluição serial na segunda placa de diluição serial. Em seguida, adicione 100 microliters de mídia experimental a isso.
Misture bem. Se o seu fermento não tiver uma tendência a flocular, então eles estão prontos para serem adicionados à placa de microscópio diretamente após esta etapa. Prossiga imediatamente para o revestimento.
No entanto, se as cepas de levedura que você está usando têm uma tendência moderada de floculação, a seguinte etapa de sônica opcional será necessária. Se sonicar, primeira pipeta misture a solução de levedura mais uma vez, antes da sônica. Coloque a levedura diluída sobre o sonicator e submerse os pinos de 96 poços na solução de cada poço, mas não toque na parte inferior do poço.
Defina o programa de sonicação, que é suficientemente forte para quebrar células de levedura floculadas, mas não mata células ou causa respostas elevadas de estresse. Alguns testes podem ser necessários para identificar o melhor programa de sônica para um determinado experimento. Uma vez que o programa esteja concluído, remova as células e prossiga imediatamente para o próximo passo.
Adicione 15 microlitros de levedura da segunda placa de diluição serial na placa de microscópio. Pipeta para cima e para baixo para misturar, mas fazê-lo cuidadosamente para evitar perturbar o Concanavalina A preso ao fundo dos poços da placa. Em seguida, adicione 200 microlitros de mídia experimental a um volume final de 400 microlitros, à placa de microscópio.
Mistura de pipeta com cautela. Cubra a placa com uma membrana respirável. Certifique-se de que as bordas da placa estão bem seladas.
Centrifugar a placa do microscópio com um fiapo e tecido livre estático por baixo dele por dois minutos a 411 vezes G para que as células de levedura se conectem à Concanavalina A na parte inferior da placa. A placa está pronta para ser image. No microscópio, limpe a parte superior e a parte inferior da placa com um fiapo e lenço livre estático e sopre ar comprimido na parte inferior da placa para remover detritos.
Coloque a placa no microscópio. Certifique-se de que o poço A1 está no canto superior esquerdo e que o microscópio está aquecido à temperatura correta para o crescimento celular. Certifique-se também de que a placa está bem enfiada no microscópio e que a parte inferior da placa é plana.
Se a placa tiver uma tampa de plástico, remova-a antes de iniciar a microscopia. Isso será importante para capturar boas imagens para análise a jusante. Carregamos um arquivo gerado automaticamente com as coordenadas X e Y e as posições focais para imagem de toda a placa de microscópio.
Se usar um arquivo pré-gerado, verifique algumas posições na placa de microscópio para garantir que as células estejam no plano focal correto. É útil para o plano focal estar ligeiramente acima das células para que eles sejam cercados por uma borda escura e eles são mais brilhantes do que o fundo. Defina o número de pontos de tempo e o espaçamento de ponto de tempo que você usará para o experimento.
Se você estiver coletando dados de taxa de crescimento e intensidade de fluorescência, configure um programa de imagem de fluorescência também. Ajuste o brilho em cada canal a ser visualizado para que nenhuma posição na placa do microscópio seja superexposta. Teste a exposição que você usará quando não estiver no modo ao vivo.
Para imagens fluorescentes, a fluorescência deve ser visível a olho nu. Mas, caso contrário, recomendamos definir baixos valores de exposição. Colônias apropriadamente espaçadas semeadas por células individuais crescem em uma monocamada ao longo da superfície da placa.
Como resultado, a análise automatizada de imagens pode ser usada para calcular com precisão a taxa de crescimento de muitas microcolônias individuais. Marcadores fluorescentes podem ser usados para diferenciar múltiplas cepas que crescem no mesmo poço. Como resultado, podem ser calculadas distribuições inteiras de taxas de crescimento para microcolônias individuais que crescem em um ambiente compartilhado.
Os grandes tamanhos amostrais alcançáveis com este experimento também permitem uma estimativa precisa das diferenças médias entre diferentes cepas ou condições de crescimento. Aqui, são mostradas taxas de crescimento para conjuntos de colônias cultivadas em poços únicos a partir de um conjunto de linhas de acumulação de mutação e as colônias de controle de referência GFP em poços são mostradas. Se as células forem observadas agrupando-se na placa do microscópio, os aglomerados devem ser quebrados por sônica antes do revestimento.
Células em aglomerados que não são quebrados não crescerão em uma microcolonia planar ao longo da superfície da placa, tornando impossível o cálculo correto da taxa de crescimento. Nem todos os meios de comunicação são compatíveis com o ensaio da taxa de crescimento da microcolonia. Algumas formas de mídia, incluindo mídia que contém extrato de levedura ou tem um pH baixo, impedem a ligação das células à Concanavalina A.Isso resulta em células flutuando longe de microcolônias em crescimento ao longo do experimento e uma taxa de crescimento errônea.
É importante evitar emplacamento de células muito densamente. Quando as células são banhadas muito de perto, microcolônias de crescimento mais rápido se fundem em pontos de tempo anteriores, mostrados aqui como uma perda de rastreamento de cores. Esse efeito pode influenciar as estimativas de taxa de crescimento, uma vez que colônias de crescimento lento são menos propensas a se fundir com seus vizinhos antes que dados de pontos de tempo suficientes sejam coletados.
Dependendo das condições de crescimento, um subconjunto de células pode passar por uma fase de defasagem antes de começar a crescer. É importante explicar isso ao usar áreas de colônia para calcular a taxa de crescimento em vez de encaixar uma curva de crescimento em todos os pontos de tempo disponíveis. O protocolo descrito pode ser usado para investigar uma ampla gama de questões relacionadas ao crescimento e evolução da levedura.
Seu formato flexível de microplaco significa que ele pode ser adaptado a outras espécies de leveduras, diferentes condições de crescimento, outros micróbios e potencialmente outras células na cultura.
