Este protocolo em ervas medição contínua de circuitos genéticos em E.coli e o cálculo da variabilidade do sinal e relação sinal-ruído em células bacterianas individuais para avaliar o desempenho do circuito. As principais vantagens desta técnica são que ela é facilmente adaptável a diferentes cepas e laboratórios, requer treinamento mínimo e sem equipamentos especiais, e é relativamente barata. O ruído é um papel significativo na determinação da funcionalidade dos sistemas biológicos.
Atualmente, há interesse em construir circuitos genéticos em larga escala. Estes sistemas podem ser inibidos pelo ruído Certifique-se de secar bem as amostras, para manter as almofadas de frio a quatro graus Celsius pelo maior tempo possível, e para cortar e dividir as partes pacientemente e suavemente. Preparar as bactérias para a análise inocular uma única colônia de uma cultura E.coli transfeinada.
Por exemplo, um circuito com um repórter GFP. Em um tubo de vidro contendo cinco mililitros de caldo LB complemento-o com os antibióticos relevantes. Cresça as células a 37 graus Celsius e 250 revoluções por minuto em uma incubadora agitada por duas horas até que o caldo esteja nublado.
No final da incubação, gire um mililitro de solução de diluição em uma mini centrífuga de dois mililitros, e transfira 30 microliters de bactérias e todo o volume de solução de diluição em um novo tubo de dois mililitros. Em seguida, incubar a cultura por uma hora com agitação antes de semear 40 a 60 microliters desta suspensão em placas de cultura M9. Para preparar as bactérias para a análise, inocular uma única colônia de uma cultura E.Coli transfeinada.
Por exemplo, um circuito com um repórter GFP em um tubo de vidro contendo cinco mililitros de caldo LB complementado com os antibióticos relevantes. Cresça as células a 37 graus Celsius e 250 revoluções por minuto em uma incubadora agitada por duas horas até que o caldo esteja nublado. No final da incubação, gire um mililitro de solução de diluição em um tubo de micro centrífugas mini mililitros e transfira 30 microliters de bactérias e todo o volume de solução de diluição em um novo tubo de dois mililitros.
Em seguida, incubar a cultura por uma hora com agitação. Para preparar placas de microscópio, misture 112,5 miligramas de ágar de baixa fusão com 40 miligramas de ágar, e um mililitro de 2% de casaminoácido em um frasco erlenmeyer de 25 mililitros. Em seguida, adicione 8,92 mililitros de meio mínimo sobre os lábios internos de um frasco Erlenmeyer de 25 mililitros e micro-ondas a solução resultante em suma, duas a três rajadas de dois segundo.
Em seguida, coloque o banho de água para 55 graus Celsius. Quando a solução estiver clara, coloque o frasco de 25 mililitros Erlenmeyer em um banho de água de 60 graus Celsius e deixe a solução de ágar esfriar até que sua temperatura caia para cerca de 45 a 50 graus Celsius. Enquanto o ágar esfriar, limpe o banco do laboratório com 70% de etanol e suavize um pedaço de fita de laboratório no banco limpo.
Coloque uma tampa de vidro na fita e coloque uma segunda tampa de salto por perto. Adicione a solução de ágar resfriado aos antibióticos e solução apropriados. Despeje 1,5 mililitros de solução recém-preparada para gelar sobre o deslizamento de tampa colocado sobre a fita e coloque a segunda tampa escorregar sobre o gel, tomando cuidado para evitar bolhas.
Devolva o Erlenmeyer ao banho de água quente e cubra os deslizamentos de cobertura por 20 minutos. Vire os deslizamentos de cobertura para uma incubação de uma hora a quatro graus Celsius. No final da incubação, retire os deslizamentos de cobertura do gel seco e corte uma pequena almofada da agarose.
Durante a incubação, adicione seis gotículas de microliter da suspensão bacteriana preparada em um prato de 35 milímetros e deixe as gotas secarem por pelo menos 15 a 30 minutos. Em seguida, coloque cuidadosamente a almofada de cada vez em uma gota de bactérias e deixe as amostras fixarem por 20 minutos em temperatura ambiente. Para colocar a cama de ágar sem manchar a amostra, posicione cuidadosamente a almofada fria sobre a gota com toques suaves.
Para imaginar as amostras, remova o frasco da água e deixe a solução em gel esfriar até a temperatura corporal. Despeje três milímetros do gel no perímetro da placa de amostra. Quando a agarose se solidificar, sele a placa com fita adesiva e use uma agulha de calibre 25 para colocar vários furos na fita.
Em seguida, coloque a placa de cabeça para baixo a quatro graus Celsius por pelo menos 30 minutos para permitir que a agarose se solidifique totalmente, enquanto previne a mitose celular. Dentro de 24 horas, use um microscópio confocal de fluorescência para localizar a amostra na menor ampliação e engajar o sistema de foco automático do microscópio. Aplique óleo ao objetivo adequado e use o controlador da plataforma para mover a placa para espalhar cuidadosamente o óleo.
Em seguida, acione o foco automático novamente e siga a sugestão padrão de seções transversais de passo Z para a imagem da amostra. O E.coli deve aparecer como formas oblongas pretas em um fundo off white. E o alcance dinâmico da luminância deve mostrar um pico em seu centro.
Eventos de mitose podem ser detectados primeiro por microscopia de fluorescência após 30 minutos. Embora células individuais possam ser difíceis de detectar em baixa ampliação. Culturas de células bacterianas preparadas em uma proporção de diluição incorreta podem demonstrar um número imutável de células, e amostras preparadas sem vedação de placas podem apresentar encolhimento excessivo, resultando em perda de foco.
As células também podem indentar o gel em sua busca por nutrientes, resultando no empilhamento das células bacterianas em cima umas das outras e comprometendo a monocamada celular, impedindo efetivamente a detecção celular e a medição confiável do sinal fluorescente. Como sugerido por esses dados, o estágio celular no ciclo de divisão não afeta o nível de ruído, pois diferentes faixas de área demonstram a mesma tendência. Além disso, não observada nenhuma alteração substancial na relação sinal-ruído entre gfp e gfp superfold, conforme ilustrado por esses dados representativos.
Ao realizar este procedimento, tome cuidado para determinar a razão de diluição correta para a cepa bacteriana utilizada para o experimento. Comparar a relação sinal-ruído de cada circuito regulamentado com esta linha de base permite a seleção do melhor circuito de desempenho e pode revelar fenômenos interessantes
