Agradecemos Sergei Demin e Tatyana Karamysheva por sua ajuda com a preparação cromossômica e FISH em Anopheles. Agradecemos também a David Severson por nos proporcionar Aedes e Culex DNA genômico BAC clones e Melissa Wade para a edição do texto. Este trabalho foi financiado por duas subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde: 1R21 AI88035-01 para Maria V. Sharakhova e 1R21 AI094289-01 para Igor V. Sharakhov.

<ol>
	<li>Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V., Verrity, J. F., Abbington, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome Mapping Research Developments. , (2008).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li><li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+the+Anopheles+gambiae+PEST+genome+assembly.">Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly.</a> Genome biology. 8, R5 (2007).</li><li>Campos, J., Andrade, C. F., Recco-Pimentel, S. 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Não há conflitos de interesse declarados.

Não fluorescente na hibridação in situ em cromossomos mitóticos dos mosquitos foi realizada pela primeira vez em 1990 por A. Kumar e Rai K. 17. Nesse estudo, 18S e 28S do DNA ribossomal, clonados juntos em um plasmídeo, foram colocadas para os cromossomas de 20 espécies de mosquitos. A sonda de ADN foi marcada radioactivamente e hibridada com os cromossomas de gânglios cérebro. Entre três gêneros de mosquitos, uma técnica de FISH foi desenvolvido apenas para cromossomos mitóticos a partir da linha de células de Ae. aegypti 10,18,19 e nunca foi realizada em cromossomos mitóticos de mosquitos vivos. Recentemente, foi desenvolvida uma técnica simples e robusta para a obtenção de preparações de alta qualidade dos cromossomos de IDs de 4 larvas ínstares 9. Este método permite que um grande número de cromossomas para ser obtido de uma corrediça e pode ser universalmente utilizado para todas as espécies de mosquitos. A necessidade de utilizar apenas sta não larval, pupal ou adultoges de mosquitos, para preparação da lâmina é provavelmente a única limitação do método. O método padrão FISH 12 foi otimizado para uso genômica BAC clone e IGS rDNA como sondas para os cromossomos mitóticos de Aedes, Culex e Anopheles. Para além destas aplicações específicas, os protocolos de FISH descritas aqui podem também ser usados ​​para outros fins. O protocolo de FISH avançado, que utiliza fracções de ADN C 0 t para bloquear a hibridização não específica, também pode ser aplicado para a hibridação de clones BAC ou quaisquer outros fragmentos de DNA em grandes regiões de Anopheles heterocromatina. Regiões heterocromáticas são enriquecidas com elementos transponíveis e repete outros, e sondas dessas regiões produzem normalmente sólida sobre os três cromossomos. Usando Unlabeled C 0 frações de DNA t vai ajudar a reduzir a hibridação inespecífica da sonda para os cromossomos. A versão simples do FISH protocol pode ser usado para qualquer rDNA ou as sondas de ADN repetitivo em cromossomos mitóticos de mosquitos e outros insectos. Além disso, também pode ser aplicado para a hibridação de DNA clone BAC em espécies com baixo teor de ADN repetitivo em regiões totalmente eucromático como Anopheles ou Drosophila. O protocolo proposto aqui vai ajudar a obter altamente acabados assembléias cromossomo base do genoma do mosquito e pode ser amplamente utilizado para aplicações de citogenética vários outros grupos de insetos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> MZ6 estereomicroscópio Leica </td><td> Leica </td><td> VA-OM-E194-354 </td><td> Um estereomicroscópio diferente pode ser usado </td></tr><tr><td> Olympus CX41 microscópio de fase </td><td> Olimpo </td><td> CX41 </td><td> Um microscópio de fase diferente pode ser usado </td></tr><tr><td> Olympus BX61 microscópio fluorescente </td><td> Olimpo </td><td> BX61 </td><td> Um microscópio fluorescente diferente pode ser usado </td></tr><tr><td> Deslize ThermoBrite Sistema de Desnaturação / Hibridização </td><td> Abbott Molecular </td><td> 30-144110 </td><td> Serve como um bloco de aquecimento e uma câmara úmida </td></tr><tr><td> Agulhas de dissecação </td><td> ScienceTools Belas </td><td> 10130-10</td><td></td></tr><tr><td> Porta agulhas </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26018-17 </td><td></td></tr><tr><td> Tesouras de dissecação </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-03 </td><td></td></tr><tr><td> 75x25 dupla fosco micro desliza </td><td> Corning </td><td> 2949-75x25 </td><td></td></tr><tr><td> 22x22 mm lamínulas de microscópio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-10 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> Borracha Cimento </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50-949-105 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Fisher Scientific </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Prova de álcool 200 </td><td> Decon Laboratories </td><td> 2701 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido propiônico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 402907 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido clorídrico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> Di-hidrato de citrato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tri-hidrato de acetato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP334-500 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP152-1 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 10x </td><td> Invitrogen </td><td> P5493 </td><td></td></tr><tr><td> 10% NBF (formalina tamponada neutra) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP227500 </td><td></td></tr><tr><td> Sal de sódio de sulfato de dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8906 </td><td></td></tr><tr><td> 20x tampão SSC </td><td> Invitrogen </td><td> AM9765 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM de iodeto de YOYO-1 (491/509) de solução </td><td> Invitrogen </td><td> Y3601 </td><td></td></tr><tr><td> Antifade Prolongar reagente Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=P36930" target="_blank">P36930</a> </td><td></td></tr><tr><td> dATP, dCTP, dGTP, dTTP </td><td> Fermentas </td><td> R0141, R0151, R0161, R0171 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3-dUTP, Cy5-dUTP </td><td> GE Healthcare </td><td> PA53022, PA55022 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Polimerase I </td><td> Fermentas </td><td> EP0041 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Fermentas </td><td> EN0521 </td><td></td></tr><tr><td> S1 nuclease </td><td> Fermentas </td><td> EN0321 </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18038-042 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-99-4 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> USB </td><td> 9001-75-6 </td><td></td></tr><tr><td> ADN de esperma de salmão </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D7656 </td><td></td></tr><tr><td> Nonidet-P40 (NP40) </td><td> EUA Biológica </td><td> NC9375914 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Blood and Maxikit Cultura Celular </td><td> Qiagen </td><td> 13362 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Kit construir grandes </td><td> Qiagen </td><td> 12462 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes

Hibridação fluorescente in situ (FISH) é uma técnica habitualmente usada por muitos laboratórios para determinar a posição cromossómica de sondas de DNA e RNA. Uma importante aplicação do presente método é o desenvolvimento de mapas de alta qualidade físicas úteis para melhorar os conjuntos do genoma de vários organismos. O padrão natural de bandas dos cromossomos politênicos e mitóticos fornece orientação para o ordenamento preciso e orientação dos supercontigs genômicos. Dentre os três gêneros de mosquitos Anopheles, ou seja, Aedes, Culex e, uma bem estabelecida técnica de mapeamento baseado cromossomo foi desenvolvido apenas para Anopheles, cujos membros possuem cromossomos politênicos legíveis 1. Como resultado dos esforços de mapeamento do genoma, 88% da Uma. gambiae genoma foi colocado para posições precisas cromossoma 2,3. Dois gêneros de mosquitos Aedes outros, e Culex, que mal polytenized b cromossomosomo de super-representação significativa de elementos transponíveis em seus genomas 4, 5, 6. Apenas 31 e 9% dos supercontings genômicas foram atribuídos sem ordem ou orientação de cromossomos de Ae. aegypti 7 e CX. quinquefasciatus 8, respectivamente. Preparação mitótico cromossoma para estas duas espécies tinham sido previamente limitado aos gânglios cerebral e linhas celulares. No entanto, as lâminas cromossoma preparadas a partir de gânglios cérebro de mosquitos geralmente contêm baixos números de placas de metafase 9. Além disso, embora a técnica FISH foi desenvolvido para cromossomas mitóticos a partir de uma linha de células de Ae. aegypti 10, a acumulação de múltiplos rearranjos cromossômicos em cromossomos das células da linha 11 torna inútil para mapeamento do genoma. Aqui descrevemos uma técnica simples e robusta para a obtenção de alta qualidade de preparações cromossômicas mitóticas de discos imaginais (IDs) de 4 larvas ínstares, que cum ser utilizado para todos os três géneros de mosquitos. Um protocolo de FISH padrão de 12 é otimizado para uso de clones BAC de DNA genômico como uma sonda em cromossomos mitóticos de Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus., e para a utilização de um espaçador intergênica (IGS) região do DNA ribossomal (rDNA) como uma sonda em um. cromossomas gambiae. Além de mapeamento físico, a técnica desenvolvida pode ser aplicada a citogenética de populações e taxonomia cromossoma / sistemática de mosquitos e grupos de outros insectos.

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Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Dentre os três gêneros de mosquito, ou seja,<em&gt; Anopheles,</em&gt;<em&gt; Aedes</em&gt;, E<em&gt; Culex</em&gt;, Técnicas de mapeamento do genoma físicas foram estabelecidos apenas para<em&gt; Anopheles</em&gt;, Cujos membros possuem cromossomos politênicos legíveis. Para os gêneros de<em&gt; Aedes</em&gt; E<em&gt; Culex</em&gt; No entanto, o mapeamento de citogenética permanece desafiador por causa da má qualidade dos cromossomos politênicos. Aqui apresentamos um protocolo universal para a obtenção de alta qualidade preparações de cromossomos mitóticos e um protocolo FISH otimizado para os três gêneros de mosquitos.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

25.5K visualizações.  Virginia Tech. Dentre os três gêneros de mosquito, ou seja, Anopheles, Aedes, E Culex, Técnicas de mapeamento do genoma físicas foram estabelecidos apenas para Anopheles, Cujos membros possuem cromossomos politênicos legíveis. Para os gêneros de Aedes E Culex No entanto, o mapeamento de citogenética permanece desafiador por causa da má qualidade dos cromossomos politênicos. Aqui apresenta...