Os autores agradecem a Vanessa Meldener-Harrell pela leitura crítica do manuscrito.

O uso de camundongos como fonte de sangue para alimentação de moscas de areia foi realizado de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Os invertebrados não estão cobertos pelas diretrizes do NIH.
1. Preparação da agulha(Figura 1)
<ol><li>Puxe agulhas e bisel como descrito em Meuti e Harrell19. Brevemente, puxe agulhas em um puxador de micropipette de vidro de dois estágios, usando capilares de vidro borossilicato.</li>
	<li>Afie as agulhas molhadas no beveller de micropipette, usando uma pedra extra fina.</li>
</ol>2. Coleta e micromanipulação de embriões (Figura 2)
<ol><li>Cinco dias antes do dia da injeção, a alimentação sanguínea e as fêmeas voam fêmeas como realizada rotineiramente para a manutenção da colônia. Para obter detalhes sobre as colônias de moscas de areia que criam procedimentos e material necessário, consulte Lawyer et al.1 Mantenha os insetos em incubadoras com 70% de umidade e 26 °C, durante todo o seu desenvolvimento.<ol>
<li>Um dia, após a alimentação sanguínea, capture fêmeas alimentadas com sangue por grupos de 100-150 em potes de gesso com uma porta lateral. Mantenha as fêmeas alimentando-as com solução de açúcar (30% de sacarose – volume suficiente para absorver uma pequena bola de algodão) o que é comum para a manutenção da colônia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia 2-3 pós alimentação sanguínea, NÃO umedeça os potes de gesso. Manter as fêmeas em um substrato seco evitará a colocação prematura de ovos, uma vez que as fêmeas preferem colocar ovos em um ambiente úmido.</li>
	<li>No dia 5 pós-alimentação sanguínea, realize a coleta de embriões, micromanipulação e microinjeção. Introduza um papel filtro úmido na câmara de colocação de ovos. Embriões recém-colocados não têm um acorde totalmente desenvolvido e parecem brancos. Use papel filtro preto durante o procedimento para facilitar a visualização dos embriões brancos.</li>
	<li>Transfira um pequeno grupo de fêmeas da panela de gesso para a câmara de colocação de ovos através das portas laterais usando um aspirador bucal. A presença de um substrato úmido (o papel filtro) induz as fêmeas a oviposit.</li>
	<li>Depois de 30-60 min, recupere cuidadosamente o papel filtro com embriões recém-colocados da câmara. Mantenha o papel filtro e os embriões em uma placa de Petri por até 3 horas. Durante este tempo, avalie regularmente o nível de umidade do papel filtro para garantir que ele permaneça úmido. Durante esse período, repita as etapas 2.4 a 2.6 com novos grupos de fêmeas e colete o maior número possível de embriões.</li>
	<li>Prepare slides de microscópio para a injeção: colete manualmente os ovos um a um com um pincel muito fino e transfira-os cuidadosamente para outro pedaço de papel filtro preto úmido colocado em um slide de microscópio coberto com uma mancha de vidro.<ol>
<li>Adicione água ao papel filtro, o suficiente para manter os embriões úmidos, mas não fazendo com que flutuem para longe da tampa ou sejam sugados sob a tampa. Alinhe os embriões contra o deslizamento. O deslizamento de cobertura age como um backstop impedindo que os ovos se afastem durante a injeção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injeções de Embriões(Figura 3)
<ol><li>Iniciar injeções de 2,5 a 3 horas após o início da coleta de ovos. Realizar injeções à temperatura ambiente e umidade do laboratório ambiente.</li>
	<li>Certifique-se de que os embriões alinhados tenham água suficiente para que sejam mantidos úmidos. NOTA: É fundamental que os embriões sejam mantidos úmidos durante as injeções. Se não estiverem úmidos durante o processo de injeção, as injeções se tornam difíceis porque a agulha tem problemas para perfurar o embrião. A quantidade correta de água é o ponto em que os embriões têm um menisco de água ao seu redor, mas o deslizamento não está flutuando em cima da água fazendo com que os embriões empurrem sob o deslizamento de cobertura. É fundamental monitorar a quantidade de água ao redor dos embriões durante as injeções. Adicione água conforme necessário para manter os embriões úmidos.</li>
	<li>Adicione a água cuidadosamente, molhando uma escova com água e transferindo a água para a parte de trás do papel do filtro. Adicionar água desta forma permite que a água seja adicionada de forma lenta e controlada para que apenas o suficiente seja adicionado para manter os embriões úmidos. Muita água pode fazer com que os embriões flutuem para fora do alinhamento, dificultando a injeção dos embriões.</li>
	<li>Misture a injeção de carga na agulha de microinjeção. Adicione aproximadamente 0,5 a 1 μL de mistura de injeção na agulha usando um enchimento de agulha borossilicato desenhado à mão, as pontas de tubulação de carregamento de gel também podem ser usadas. A mistura de injeção é composta de um ou vários RNA guia (80 ng/μL cada) projetado para atingir um lócus específico misturado com proteína Cas9 recombinante comercial (300 ng/μL).</li>
	<li>Começando com a pressão de injeção a 30 psi, pressione o gatilho de injeção para expulsar o ar da ponta da agulha. Isso forçará a mistura de injeção à ponta da agulha permitindo que a mistura de injeção flua. Neste ponto, aumente lentamente a pressão de espera/constante até que o material de injeção comece a fluir, em seguida, recue a pressão de espera/constante para que ele fique logo abaixo do ponto da mistura de injeção que flui da agulha. O ambiente fechado deve fornecer apenas material de injeção suficiente para que uma pequena quantidade de material possa ser vista para entrar no embrião. NOTA: A injeção de embriões de mosca de areia sob óleo de halocarbono semelhante a outros protocolos usados para Drosophila e mosquitos foi inicialmente testada, porém a porcentagem de sobrevivência dessas injeções foi muito baixa. A sobrevivência foi melhorada com a mudança para injeções em papel filtro úmido como descrito acima.</li>
	<li>Insira a agulha na lateral do embrião. Use o deslizamento atrás do embrião como um backstop que ajudará a agulha a perfurar o embrião. Entregue uma pequena quantidade de mistura de injeção no embrião antes de remover suavemente a agulha.</li>
	<li>Imediatamente após a remoção da agulha, pressione o injetor para remover qualquer material reabastecado da ponta da agulha. Isso ajudará a evitar que a agulha entupisse.</li>
	<li>Vá para o próximo embrião. Entre cada injeção, certifique-se de que o papel do filtro está úmido e que a agulha não está entupida.</li>
	<li>Uma vez que todos os embriões tenham sido injetados, conte o número de embriões injetados para manter uma contagem de execução.</li>
	<li>Remova a mancha de cobertura adicionando água ao papel do filtro para que a mancha de cobertura flutue. Neste ponto, use uma sonda (vara aplicadora de madeira com pino de inseto colado na ponta) para manter o papel filtro no lugar enquanto um dedo é usado para puxar a tampa para longe dos embriões injetados.</li>
	<li>Limpe o excesso de água do papel do filtro uma vez que a mancha de cobertura tenha sido removida.</li>
</ol>4. Criação pós-injeção (G0)(Figura 4)
<ol><li>Transfira o papel filtro com os embriões em cima de várias camadas de papel filtro úmido colocado em uma placa de Petri para manter a umidade. Mantenha os embriões aqui durante o tempo necessário para injetar outros embriões. Embriões podem ser mantidos por um máximo de 3 horas como este. Após a injeção, eles vão lentamente ficar marrons.</li>
	<li>Uma vez que todos os embriões tenham sido injetados, transfira manualmente-os para potes de gesso de pequeno porte previamente umedecidos. Não coloque muitos embriões em cada pote e mantenha distância entre eles, para evitar uma possível contaminação fúngica entre os indivíduos. Cubra os potes com uma tela e armazene-os como normalmente seria feito para ovos de colônia de moscas de areia, mantidos em incubadoras a 70% de umidade e 26 °C, durante todo o seu desenvolvimento.</li>
	<li>No primeiro dia pós-injeção, remova todos os embriões danificados e mortos com um pincel. Adicione 100 μL de ácido propiônico de 0,5%, gota a gota, nos potes de gesso contendo os embriões injetados para limitar a contaminação fúngica. A liberação de citoplasma de embriões danificados durante o processo de injeção é particularmente favorável ao crescimento fúngico.</li>
	<li>Verifique os potes de gesso todos os dias e remova os embriões ruins ou mortos. Se o fungo estiver presente, remova todos os embriões infectados e adicione algumas gotas de ácido propiônico de 0,5%.</li>
	<li>Larvas eclodem entre os dias 8 e 12 pós-injeção. Duas vezes por dia, transfira as larvas recém-emergidas para novos potes de gesso, em grupos de 5-10 no máximo. Adicione uma pequena quantidade de comida e verifique a comida 2-3 vezes por semana.<ol>
<li>Monitore cuidadosamente a quantidade de alimentos larvais, pois aumenta muito o risco de contaminação fúngica. Larvas de mosca de areia sobrevivem melhor em grupos, porém podem ser canibais se não houver comida suficiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando as larvas pupar, separe-as por sexo para manter as fêmeas como virgens. Se houver muitos sobreviventes, descarte os machos e mantenha apenas as fêmeas. NOTA: Tanto os machos quanto as fêmeas podem carregar e transmitir mutações. No entanto, como as fêmeas têm que ser mantidas virgens antes de serem cruzadas, é mais fácil usar apenas as fêmeas injetadas do G0 para evitar ter que separar os insetos wt por sexo. Os machos G0 podem ser mantidos como reforço se o número de sobreviventes adultos for baixo e, neste caso, será acasalado com fêmeas virgens classificadas.</li>
</ol>5. Seleção e triagem de alelos mutantes(Figura 5)
<ol><li>Cruze em massa as fêmeas G0 com machos em uma gaiola. Alimenta-os completamente, como seria feito para a manutenção normal da colônia.</li>
	<li>Um dia, após a alimentação sanguínea, transfira cada fêmea G0 com machos de 2-3 wt em tubos individuais de gesso usando um aspirador bucal. Alimente as moscas com açúcar em uma pequena bola de algodão trocada todos os dias e use uma seringa de água para garantir que a umidade do gesso seja adequada para a colocação de ovos.</li>
	<li>Após as fêmeas G0 colocarem ovos (correspondentes ao G1),recolher seus corpos em tubos Eppendorf anotados para genotipagem posterior. Mantenha os embriões como normalmente feito para colônias wt.</li>
	<li>Extrair o DNA das fêmeas G0 pelo método de escolha.</li>
	<li>Trie o DNA para a presença de mutações, por exemplo, projetando um ensaio pcr usando primers em torno da região de cortes crocantes esperados.</li>
	<li>Mantenha apenas os embriões G1 colocados por fêmeas G0 mostrando evidências de transformação. Quando esses embriões G1 se desenvolverem em pupas, separem-nos pelo sexo e mantenham apenas as fêmeas. Cruze as fêmeas G1 do mesmo sexo feminino G0 para os machos, alimenta-os com sangue, depois transfira em pequenos grupos de 2-3 fêmeas e 4-5 machos em recipientes de pequeno porte. NOTA: Todos os indivíduos do G1 têm a chance de carregar uma mutação única, portanto, se o número de indivíduos sobreviventes não é muito alto, então é melhor cruzar as fêmeas G1 individualmente com os machos wt. O caso de várias fêmeas carregando uma mutação diferente presente em um mesmo tubo é raro, mas pode ocorrer. Se esse caso for observado após a genotipagem, as fêmeas progêneras G2 devem então ser acasaladas individualmente para os machos wt. Este esquema de acasalamento evita a possibilidade de múltiplas mutações na prole.</li>
	<li>Após a colocação de ovos, colete os corpos femininos G1 e trie-os para mutações. Mantenha apenas os tubos onde pelo menos uma fêmea mostrou evidência de mutação.</li>
	<li>Para gerações posteriores fazer um par único em cruzes. Depois da colocação de ovos, pais de tela para a presença de mutação. Repita em cada geração até que ambos os pais sejam homozigosos para a mesma mutação. Uma vez identificados, eles serão os fundadores de um estoque mutante homozigoso.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae).">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42 (2017).</li><li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9:+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells.">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li><li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival.">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li><li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. 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Apresentamos aqui um método de microinjeção de embriões recentemente desenvolvido para mutagênese direcionada por CRISPR/Cas9 em moscas de areia Phlebotomus papatasi. A microinjeção de embriões para modificação genética de insetos foi desenvolvida em Drosophila em meados da década de 198021 e agora é usada rotineiramente em uma grande variedade de insetos. Outros métodos para a entrega de materiais de modificação genética foram desenvolvidos para uso em insetos, ...

As doenças transmitidas por vetores são uma grande ameaça à saúde pública em constante evolução. Centenas de espécies vetoriais espalhadas por famílias filogênicas muito distintas (por exemplo, mosquitos, carrapatos, pulgas) são responsáveis pela transmissão de um grande número de patógenos microbianos, resultando em mais de 700.000 mortes humanas por ano, de acordo com a Organização Mundial da Saúde. Entre os insetos vetoriais, as moscas de areia de flebotomina (Diptera, Psychodidae) constituem um vasto grupo, com 80 espécies vetoriais comprovadas exibindo traços fenotípicos distintos e capacidades vetoriais encontradas em diferentes regiões geográficas. São vetores para os parasitas protozoários do gênero Leishmania,causando cerca de 1,3 milhão de novos casos de Leishmanioses e entre 20.000 e 30.000 mortes por ano. Os desfechos clínicos das leishmanioses são diversos, com sintomas que vão desde lesões cutâneas auto-limitantes até disseminação visceral que é fatal na ausência de tratamento.
Moscas de areia são insetos estritamente terrestres. Seu ciclo de vida, relativamente longo em comparação com outros Diptera, dura até três meses, dependendo de diferentes parâmetros, como temperatura, umidade e nutrição. Consiste em um estágio embrionário (6 a 11 dias), quatro estágios larvais (com duração total de 23 a 25 dias) e um estágio pupal (9 a 10 dias) seguido de metamorfose e depois idade adulta. Moscas de areia requerem um ambiente úmido e quente para a criação. Tanto machos quanto fêmeas se alimentam de açúcares, obtidos na natureza a partir de néctars de flores. Apenas as fêmeas são alimentadores de sangue, pois necessitam de proteínas obtidas da farinha de sangue para a produção de ovos1.
Um foco importante da pesquisa é identificar a natureza das interações vetor/parasita que levam ao desenvolvimento de infecções transmissíveis. Assim como outros insetos vetoriais, parâmetros intrínsecos às moscas de areia têm mostrado impacto em sua competência vetorial, que é definida como sua capacidade de transportar e transmitir patógenos para seus hospedeiros. Por exemplo, a expressão de galectinas pelos phlebotomus papatasi e células midgut de mosca, agindo como receptores reconhecendo componentes da superfície parasita, pode influenciar diretamente sua competência vetorial para Leishmania maior2,3. A via de resposta imune ao inseto, Immune Deficiency (IMD), também é crucial para a competência vetorial de phlebotomus papatasi para a Leishmania maior4. Um papel crítico para as vias de resposta imune a insetos vetoriais no controle de sua transmissão de patógenos infecciosos tem sido relatado da mesma forma nos mosquitos Aedes aegypti 5,6,7, na mosca tsé-tsé Glossina morsitans8, e em Anopheles gárdias mosquitos 9,10.
Estudos de interações de moscas deareia/Leishmania têm sido limitados pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses insetos. Apenas a desregulamentação genética por RNA de pequena interferência (siRNA) havia sido realizada11,12,13,14 até recentemente. A técnica, limitada pela mortalidade associada à microinjeção de fêmeas adultas, leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração.
A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a pesquisa genômica funcional em organismos não-modelo, como moscas de areia. Modificado do sistema imunológico adaptativo em procariotes para defesa contra bacteriófagos15,16, o sistema CRISPR Cas9 foi rapidamente adaptado como uma ferramenta de edição de genomas para organismos eucarióticos superiores, incluindo insetos. O princípio da edição de genoma direcionada do CRISPR/Cas9 baseia-se na complementaridade de um único guia RNA (sgRNA) a um lócus genômico específico. A nuclease Cas9 se liga ao sgRNA e cria uma quebra de DNA de duas vertentes (dsDNA) no DNA genômico onde o sgRNA se associa à sua sequência complementar. O complexo Cas9-sgRNA é guiado à sequência de destino por 17 a 20 bases complementares no sgRNA para o lócus escolhido, o rompimento dsDNA pode então ser reparado por duas vias independentes: junção final nonhomologous (NHEJ) ou reparo direcionado à homologia (HDR)17. O reparo do NHEJ envolve um simples fechamento do intervalo, mas frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. A reparação de DNA através do HDR usa uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Insetos possuem ambas as máquinas.
A tecnologia CRISPR/Cas9 pode gerar mutações em um lócus escolhido, através da via de reparo NHEJ; ou para estratégias de edição de genomas mais complexas, como knock-ins ou repórteres de expressão, através da via HDR com um modelo de doador apropriado. Em moscas de areia, alelos mutantes nulos do fator de resposta imune Relish foram gerados através de CRISPR mediado por NHEJ em Phlebotomus papatasi4. Embriões de mosca de areia também foram injetados em outro estudo com uma mistura CRISPR/Cas9 visando a codificação genética Amarela. Ainda assim, nenhum adulto portador da mutação foi produzido18. Descrevemos aqui um método detalhado de mutagênese direcionada à mosca-da-areia pelo CRISPR/Cas9 mediado pela NHEJ, com um foco particular na microinjeção do embrião, um passo crítico do protocolo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Moscas de areia são os vetores naturais da espécie Leishmania, parasitas protozoários produzindo um amplo espectro de sintomas que vão desde lesões cutâneas até patologia visceral. Decifrar a natureza das interações vetor/parasita é de importância primária para uma melhor compreensão da transmissão de Leishmania aos seus hospedeiros. Entre os parâmetros que controlam a competência vetorial da mosca de areia (ou seja, sua capacidade de transportar e transmitir patógenos), parâmetros intrínsecos a esses insetos mostraram-se um papel fundamental. A resposta imune a insetos, por exemplo, impacta a competência vetorial da mosca da areia para a Leishmania. O estudo desses parâmetros tem sido limitado pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses organismos não-modelo. A baixa genética por RNA de pequena interferência (siRNA) é possível, mas além de ser tecnicamente desafiador, o silenciamento leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração. Mutagênese direcionada pela tecnologia CRISPR/Cas9 foi recentemente adaptada para a mosca de areia Phlebotomus papatasi. Essa técnica leva à geração de mutações transmissíveis em um lócus especificamente escolhido, permitindo estudar os genes de interesse. O sistema CRISPR/Cas9 conta com a indução de quebras de DNA de dois fios direcionados, posteriormente reparados por NHEJ (Non-Homólogos End Joining) ou por Homology Driven Repair (HDR). O NHEJ consiste em um simples fechamento da quebra e frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. Em contraste, o HDR usa a presença de uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Aqui, apresentamos um método de microinjeção de embriões de mosca de areia para mutagênese direcionada pelo CRISPR/Cas9 usando NHEJ, que é a única técnica de modificação do genoma adaptada aos vetores de mosca de areia até o momento.

O protocolo de microinjeção CRISPR/Cas9 descrito aqui para gerar mutantes de moscas de areia foi estabelecido em uma publicação anterior4. Essa abordagem produziu mutagênese altamente eficiente, já que 11 dos 540 indivíduos sobreviveram ao procedimento, dos quais 9 eram mutantes. Ao projetar guias para mutação CRISPR/Cas9, um primeiro passo crítico é sequenciar a região ao redor da área a ser alvo. O modelo para sequenciamento deve ser da cepa que será usada como fonte de embriões p...

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Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.0K visualizações.  National Institutes of Health. Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Genética

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Microinjeção de proteína CRISPR/Cas9 em bagre do canal, Ictalurus punctatus, embriões para Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteína-mediada por Gene preciso de edição por tubo Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Edição de genoma mediado por CRISPR-Cas9 no Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...