Esta técnica pode responder a importantes perguntas funcionais sobre respostas neuronais ao gosto no gânglio geniculado, uma parte crucial do caminho de gosto de chorda tympani interior. Esta técnica pode ser usada para monitorar as reações em tempo real de múltiplos neurônios individuais em um único ensaio experimental, uma vez que as células registradas por animal são significativamente maiores do que normalmente observadas através do método eletrofisiológico. Com o rato montado no posto principal na posição supina em uma almofada de aquecimento, faça uma incisão de linha média de dois centímetros na pele sobre a garganta, do esterno ao queixo.
E retrair a pele e as glândulas sub-maxilais para expor totalmente os músculos digastricos. Depois de localizar a costura na musculatura paratracheal, separe a costura com dissecção sem cortes e retrate o tecido para abri-la. Corte cuidadosamente uma abertura na parte superior da traqueia grande o suficiente para caber um pedaço de tubo de polietileno sem cortar mais da metade do diâmetro da traqueia e inserir a tubulação na traqueia em direção aos pulmões.
Reposicione os retratores para liberar a musculatura paratracheal e retrair as glândulas sub-maxilares. Em seguida, use uma pequena quantidade de cola veterinária para selar a musculatura paratracheal junto sobre o tubo. Para quebrar a bíprica timpânica, provoque suavemente o músculo digastric desejado para cima e puxe o tecido conjuntivo.
Faça uma incisão na extremidade anterior do músculo, evitando os vasos sanguíneos. E puxe para trás posteriormente até se livrar da bíprica bulla. Incline a cabeça para trás ligeiramente para levantar a bíprica e localizar o ramo da artéria carótida anterior ao ponto de inserção posterior do músculo digastric.
Palpate apenas posterior a este vaso sanguíneo para a estrutura convexa da bíptico bíptico e localize uma costura na musculatura. Usando dois conjuntos de fórceps finos, dissecar sem cortes na costura até que o osso da bímpula timpânica seja visível e use retrações para manter uma visão clara do osso. Localize a costura correndo de anterior para posterior na bula e use uma sonda cirúrgica para fazer um orifício no osso no centro da costura, em seguida, use um conjunto de tesouras finas para cortar uma área circular no osso, tomando cuidado para não cortar vasos sanguíneos e posterior para ou abaixo da bula.
Para expor o geniculado, localize a cóclea. Anterior à cóclea é o músculo tensor tympani. Use a tesoura de mola para cortar e remover este músculo.
Use a sonda cirúrgica para fazer um furo no promontório coclear e use imediatamente a sucção para aspirar qualquer líquido que flua para fora do orifício. Amplie o orifício na cóclea, tomando cuidado para não danificar o vaso sanguíneo que circunda a cóclea, até a borda posterior e lateral. E incline a cabeça do rato para a frente para localizar o buraco no osso temporal sob a antiga estrutura coclear.
Tome nota do cume anterior para o buraco que se senta diretamente sobre o sétimo nervo. E insira uma sonda cirúrgica no buraco para permitir que o osso temporal seja cuidadosamente levantado para expor o sétimo nervo. Se o geniculado não estiver totalmente visível, incline suavemente a cabeça do animal para trás e tente puxar o osso anterior para o nervo.
Se o gânglio ainda estiver obscurecido, puxe mais osso por baixo, tomando cuidado para não colocar a sonda bem abaixo do osso, pois isso pode danificar o geniculado. Para executar o painel tastant, use suctioned para remover o líquido de sobre o geniculado e coloque o mouse em uma almofada absorvente sob um microscópio dissecando. Use o buraco deixado na bula, o buraco no osso temporal, e o sétimo nervo para localizar o gânglio geniculado.
E use o filtro FITCGFP no escopo epifluorescente para verificar se há neurônios glion geniculados individuais. Coloque a agulha de distribuição para uma linha tastante firmemente na boca do animal e coloque uma placa de Petri abaixo da boca para pegar qualquer fluido. Sincronizar o início da gravação de vídeo com o início da apresentação tastant, assistindo a transmissão ao vivo para respostas, deriva e infiltração durante a gravação.
Se ocorrer a infiltração, sucção do líquido até que a visão do geniculado esteja clara e redeliver o tastant. Se ocorrer deriva, verifique se todas as partes do poste estão firmemente apertadas. Se não ocorrer resposta, verifique se o líquido está fluindo e se o microscópio e a câmera estão focados no local adequado sem que nada obscurece o campo de visão.
Quando todos os experimentos desejados forem concluídos, alivie suavemente os retratores e repita a exposição e a análise tastante no lado oposto do animal. Como observado, os estímulos de paladar aplicados à língua devem resultar em um rápido aumento transitório da fluorescência GCaMP, causando uma mudança notável no brilho entre os neurônios que respondem. A análise das imagens de vídeo de fluorescência permite a geração de traços correspondentes às mudanças na fluorescência sobre a resposta da linha de base dentro de regiões individuais de interesse ao longo do tempo.
Alterações na intensidade da fluorescência acima do nível limiar são consideradas uma resposta positiva. Além de danificar os gânglios, é importante evitar sangramentos. Se ocorrer sangramento, espere o sangue coagular antes de aplicar soro fisiológico e sucção para remover o sangue do campo visual.
A visualização do gânglio geniculado permitiu aos pesquisadores medir diretamente as respostas dos neurônios a estímulos semelhantes a gosto e identificar esses neurônios com ferramentas como o GCaMP dependente de Cre.
