Nossa pesquisa se concentra nos neurônios e nos circuitos do sistema somatossensorial envolvidos na narração dos efeitos analgésicos da acupuntura na dor visceral enquanto tentamos ajustar as respostas dos neurônios do neuro DRG aos estímulos da acupuntura. Os métodos tradicionais, como a eletrogravação, não podem examinar com eficiência o número de células suficiente e os laços celulares específicos distintos para identificar os neurônios responsivos viscerais ou somáticos in vivo. Estudar os papéis funcionais do neurônio DRG no efeito analgésico da acupuntura tem sido difícil devido a restrições tecnológicas.
Introduzimos uma abordagem geral para observar a responsabilidade de um neurônio DRG número seis para simulação intracolônica e acupuntura in vivo. O protocolo descreve os procedimentos para observar a atividade dos neurônios DRG in vivo em resposta à entrada somática e vísceras. Esta é uma melhoria em relação ao estudo anterior, que se concentrou apenas no levantamento das respostas dos neurônios no DRG L5 sob os estímulos somáticos.
No futuro, com a configuração correta, a imagem CAS DRG in vivo pode ser feita em segmentos torácicos ou cervicais, fornecendo uma ferramenta mais poderosa para estudar os efeitos da nocicepção visceral e da acupuntura. Este método é essencial para os pesquisadores de acupuntura aprenderem. Para começar, coloque o camundongo traqueostomizado na posição de bruços na almofada de aquecimento.
Faça uma incisão na linha média de sete centímetros de comprimento na parte inferior das costas e estenda-a da quinta vértebra lombar até a primeira vértebra sacral. Em seguida, afaste cuidadosamente os músculos longuíssimo lombar para expor os processos espinhosos das três vértebras. Mova as partes internas do longuíssimo lombar bilateral, músculos dorsais da coluna lombar e músculos dorsais da semiespinha lombar para expor os três processos articulares e mamilares sucessivos com o segmento de registro no meio das vértebras.
Agora, imobilize com segurança o animal com pinça dentária nos processos articulares bilaterais das vértebras vizinhas. Use uma pinça rongeur para remover os processos articulares e mamilares esquerdo ou direito das quatro ou seis vértebras lombares. Exponha cuidadosamente os seis DRG lombares esquerdo ou direito depois de limpar os tecidos conjuntivos acima dele.
Certifique-se de manter o epineuro intacto no lado escolhido das seis vértebras lombares. Cubra as áreas expostas do DRG com pequenas bolas de algodão embebidas em solução salina para manter a condição ativa. Agora, conecte o sistema de administração de anestesia de baixo fluxo à cânula traqueal para intubar os camundongos.
Posicione o animal com o DRG exposto em uma almofada de aquecimento situada no palco de uma pinça espinhal personalizada. Usando dois grampos nas colunas vertebrais das vértebras vizinhas, prenda o animal para minimizar o movimento durante o teste. Em seguida, substitua as bolas de algodão umedecidas com solução salina até que a área cirúrgica esteja adequadamente limpa.
Insira o grampo espinhal personalizado no microscópio personalizado Para imagens, posicione uma lente objetiva de ar de longa distância de trabalho de um microscópio confocal sobre o DRG exposto. Capture pilhas Z com lapso de tempo do DRG lombar intacto de quatro ou seis com 25 micrômetros por passo e resolução de 512 por 512 ou 1.024 por 1.024 pixels.
Realize a varredura XYZT do DRG com quatro a oito pilhas, abrangendo um a três estados basais, dois a três estímulos de acupuntura ou distensão colorretal visceral e um a dois estados pós-estímulos. Em seguida, aplique estímulos de escovação ou pinçamento na parte inferior das costas, membro posterior ou pata traseira do animal para avaliar o campo receptivo mais sensível dos neurônios DRG imageados. Administre estímulos de acupuntura manualmente ou usando um ponto de acupuntura e estimulador de nervo disponíveis comercialmente.
Empregue a distensão colorretal com um manômetro de pressão de ar de fabricação própria para induzir estímulos viscerais. Usando um microscópio confocal, meça o aumento da fluorescência verde do GCaMP neuronal ao se ligar ao cálcio intracelular após estímulos somáticos ou viscerais. Usando o software de imagem, clareie o vídeo usando a opção de cor.
Delineie manualmente as células visíveis e determine o tamanho da célula e a intensidade relativa da fluorescência. Expresse a intensidade da fluorescência como uma razão entre o aumento da fluorescência máxima evocada e o nível basal. Os seis neurônios DRG lombares geralmente não possuem fluorescência GFP basal, possivelmente influenciada pelos níveis de expressão de GCaMP e danos cirúrgicos.
Os estímulos de distensão colorretal induziram um aumento rápido e transitório na fluorescência do GCaMP. Respostas semelhantes foram observadas com a aplicação de eletroacupuntura BL25. Mapas de calor e gráficos de linhas mostraram respostas de todos os neurônios circulados à distensão colorretal e eletroacupuntura BL25.
O histograma mostra os diâmetros dos neurônios responsivos à distensão colorretal e à eletroacupuntura BL25.
