Este protocolo resulta em extração de cromatina reprodutível e confiável de espécimes de fígado congelado para experimentos de imunoprecipitação de cromatina. Para começar, coloque o tubo contendo o tecido congelado na argamassa e deixe descansar por cinco minutos. Em seguida, aplique pressão na amostra usando um pilão pré-resfriado até que não haja mais desmoronamentos sólidos.
Retire da argamassa o tubo que contém a amostra. Adicione 950 microlitros de PBS gelado com os inibidores necessários e pipete para cima e para baixo suavemente até que a amostra seja completamente ressuspensa. Transfira imediatamente a suspensão de tecido para o homogeneizador e aplique de 20 a 30 tempos com Pilão A para obter uma suspensão mais fina.
Evite mover o pilão para fora da fase líquida para evitar a formação de espuma. Transfira o homogeneizado para um novo tubo de 1,5 mililitro previamente resfriado no gelo. Em seguida, centrifugar o tubo por cinco minutos a 1, 300 G e quatro graus Celsius.
Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet completamente em 950 microlitros de PBS à temperatura ambiente por pipetagem suave. Em seguida, adicione 63,6 microlitros de formaldeído livre de metanol a 16% para obter uma concentração final de 1%Gire imediatamente o tubo por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a rotação, adicionar 113 microlitros de glicina 1,25 molar à temperatura ambiente para obter uma concentração final de 125 milimolares e girar o tubo por mais cinco minutos.
Em seguida, centrifugar a amostra a 1, 300 G por três minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet cuidadosamente pipetando em 950 microlitros de PBS gelado com os inibidores necessários. Centrifugar novamente a amostra e ressuspender o pellet conforme demonstrado anteriormente.
Repetir novamente a etapa de centrifugação e proceder imediatamente ao procedimento de isolamento da cromatina. Adicione 950 microlitros de Buffer A com os inibidores necessários ao pellet e misture suavemente por pipetagem até que o pellet seja completamente ressuspenso. Em seguida, gire o tubo por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Após a rotação, centrifugar a amostra a 2.000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e remover cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 950 microlitros de Buffer B com os inibidores necessários ao pellet e misture suavemente por pipetagem até que o pellet seja completamente ressuspenso. Em seguida, gire o tubo por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Após a rotação, centrifugar a amostra novamente. Remova o sobrenadante. Em seguida, adicione 300 microlitros de Buffer C à temperatura ambiente com os inibidores necessários ao pellet e pipeta vigorosamente.
Vórtice a amostra por 15 a 30 segundos. Em seguida, gire o tubo brevemente para coletar as gotas na tampa. Depois de sonicar a amostra de cromatina, adicione 30 microlitros de solução de Triton X-100 a 10% e vórtice durante cinco a 10 segundos.
Centrifugar a amostra a 16.000 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius. E transfira o sobrenadante para um tubo limpo de 1,5 mililitro pré-resfriado no gelo. Transfira de 10 a 25 microlitros de cromatina cortada para um novo tubo e adicione o Buffer C para atingir um volume final de 200 microlitros.
Alíquota e choque congelar o resto da cromatina a menos 80 graus Celsius até uso posterior. Adicione oito microlitros de cloreto de sódio cinco molares e incube por pelo menos seis horas a 65 graus Celsius no bloco de aquecimento enquanto agita a 1.000 RPM. Estender a incubação durante a noite, se possível.
Depois de deixar as amostras arrefecerem à temperatura ambiente durante cinco minutos, adicione dois microlitros de RNase A e incube durante uma hora a 37 graus Celsius enquanto agita a 1.000 RPM. Retire as amostras do bloco de aquecimento e adicione sete microlitros de cloreto de cálcio 300 milimolares e dois microlitros de proteinase K. Incube as amostras no bloco de aquecimento a 56 graus Celsius por 30 minutos enquanto agita a 1.000 RPM. Enquanto isso, prepare um tubo de separação de fase para cada amostra, centrifugando-os até 16.000 G por um minuto a quatro graus Celsius.
Depois de remover os tubos do bloco de aquecimento e deixá-los se equilibrar à temperatura ambiente por três minutos, transfira 400 microlitros da amostra para o tubo de separação de fase previamente centrifugado. Em seguida, adicione 400 microlitros de solução de álcool isoamílico clorofórmio fenol e vórtice por cinco segundos. Centrifugar o tubo a 16.000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, adicione 400 microlitros de clorofórmio e vórtice por cinco segundos. Centrifugar o tubo por mais cinco minutos e transferir 400 microlitros da fase superior para um novo tubo de 1,5 mililitro que contém 24 microlitros de cloreto de sódio cinco molares e 0,75 microlitros de glicogênio. Em seguida, vórtice brevemente o tubo.
Adicione 1.055 microlitros de etanol 100%. Em seguida, vórtice completamente e incube a amostra a 80 graus Celsius negativos por uma hora ou a 20 graus Celsius negativos durante a noite. Após a incubação completa, centrifugar a amostra a 16.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius e remover cuidadosamente o sobrenadante sem deslocar o pellet.
Adicione 500 microlitros de etanol 70% frio e incline o tubo suavemente para garantir que o pellet seja lavado. Centrifugar o tubo a 16.000 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Retire cuidadosamente todo o sobrenadante e deixe o pellet secar à temperatura ambiente.
Alternativamente, incube o tubo a 37 graus Celsius para uma secagem mais rápida. Adicione 50 microlitros de solução de Tris-EDTA e coloque o tubo no bloco de aquecimento por cinco a 10 minutos sob agitação a 300 RPM. Em seguida, analise o DNA em um gel de agarose a 1%.
Após a desligação da cromatina e visualização do DNA em gel de agarose, o sucesso do cisalhamento pode ser reconhecido pela presença de fragmentos na faixa de 100 a 300 pares de bases. A cromatina foi precipitada com sucesso com anticorpos de trimetilação H3K4, acetilação H3K27 e trimetilação H3 K27 e posteriormente analisada por qPCR. As regiões promotoras da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase do cromossomo um, 43, do proteassoma 20S subunidade beta e do glicoeraldeído-3-fosfato desidrogenase, que são transcritas ativamente no fígado, mostraram enriquecimento para trimetilação de H3K4 e acetilação de H3K27.
Em comparação, as regiões promotoras do homeobox C13, C12 e do fator de transcrição de mielina de camundongo um que são silenciadas no fígado não foram enriquecidas como esperado. A trimetilação de H3 K27 apresenta comportamento oposto, confirmando o sucesso da imunoprecipitação da cromatina ou do ensaio de ChIP. A cromatina foi submetida com sucesso ao ChIP-Seq.
Após o sequenciamento, as palhetas foram alinhadas a um índice previamente preparado e separadas de acordo com a espécie. Trimetilação de H3K4 e deposição de acetilação de H3K27 em sítios de partida de transcrição gênica antagonizados com deposição de trimetilação de H3K27 como esperado. O cluster Hox C é conhecido por ser transcricionalmente inativo em fígados de camundongos e humanos.
O perfil de trimetilação de H3K4 e acetilação de H3K27 mostra picos para essas duas modificações pós-traducionais fora do cluster, enquanto a intensidade de sinal da trimetilação de H3K27 tende a aumentar dentro do cluster gênico. A extração de cromatina de espécimes de tecido congelado tem alta variabilidade intrínseca, dependendo fortemente da finura da suspensão celular e da temperatura durante a reticulação. Garantir condições laboratoriais fixas ajuda a manter a reprodutibilidade da faixa de tamanho do fragmento.
