Este trabalho foi financiado pelo 115.347-RSG-08-271-01-GMC da ACS, e por CA138631 concessão do NIH.

O protocolo foi originalmente adaptado do B. Ren, 2001. Ela representa uma ligeira modificação do protocolo por Odom et al. 5 que podem ser encontradas em <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Pré-bloco e ligação de anticorpos para esferas magnéticas (Deve ser realizada na noite anterior próximo passo) <ol><li> Lave de 100 L de Dynabeads Protein G (por IP, combine para múltiplos IPs) em 1 mL de fresco BSA / PBS solução (50 mg BSA em 10 mL PBS-Esta solução vai durar uma semana). </li><li> Recolher as contas usando um suporte magnético e repita o procedimento de lavagem mais duas vezes. </li><li> Em seguida, adicionar 10 mg de anticorpos para 250 mL da suspensão contas em PBS / BSA solução (por IP) e incubar durante a noite em uma plataforma giratória a 4 ° C. </li><li> Após a conclusão, lavar as contas três vezes em 1 ml da solução de PBS / BSA e ressuspender em 10 ml da solução de PBS / BSA (por IP). </li></ol> 2. Célula cross-linking <ol><li> Para iniciar este procedimento, crescer cerca de 10 8 células para cada imunoprecipitação, ou IP. Aqui, difuso de células U937 histiocitária linfoma são usados ​​e induziu a diferenciação monocítica com TPA de 96 horas. </li><li> Após o crescimento celular, adicione solução de formol diretamente para a mídia para uma concentração final de 1%. Então, redemoinho brevemente frascos e permitir-lhes para sentar-se à temperatura ambiente por 10 minutos. Então, aspirar a mídia e lave as células com 15 mL de PBS gelado. Repita este lave uma vez. </li><li> Em seguida, adicionar 6 mL de Tampão de Lise 1 (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, EDTA 1 mM, glicerol 10%, 0,5% NP-40, 0,25% Triton X-100, contendo inibidores da protease) para cada dos frascos no gelo. Então, rock os frascos durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Finalmente, a colheita das células usando um raspador celular e transferi-los para 15 mL tubos cônicos. Neste ponto, as células podem ser armazenadas a -80 ° C. </li></ol> 3. Sonication celular <ol><li> Se as células foram congeladas, descongele-los. Uma vez descongelado, girar a células para baixo a 3.000 rpm por 10 minutos a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Então, voltar a suspender as células em 6 mL de Tampão de Lise 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1mM EDTA, EGTA 0,5 mM, contendo inibidores da protease). Rock the tubos suavemente em temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Repetir a centrifugação e ressuspender as células em 2,5 mL de Tampão de Lise 3 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, desoxicolato de sódio a 0,1%, 0,5% N-lauroylsarcosine, contendo inibidores da protease) . </li><li> Em seguida, preparar a suspensão por sonicação, colocando-o num copo de água gelada com o MICROTIP de 450 Branson Sonifier definida entre 50 e amplitude de 60%. </li><li> Sonicate a solução para uma explosão 30 segundo constante e frio no gelo por 1 minuto. Repita estes pulsos 10 a 15 vezes. Então, pipetar o conteúdo do tubo de cima a baixo e transferi-los para um novo tubo. Continuar a pulso e esfriar a solução de um adicional de 5 vezes. </li><li> Seguintes sonicação, adicionar 10% Triton X-100 a 1 / 10 do volume de solução. Transferir os lisados ​​para tubos de 1,5 mL de centrífuga, e girar os detritos para fora em uma microcentrífuga. Em seguida, transferir o lisado celular para um novo tubo. </li></ol> 4. Cromatina Imunoprecipitação <ol><li> Antes de cromatina imunoprecipitação, ou chip, economizar 50 mL do lisado celular como a amostra de entrada. Então, combinar o lisado celular apuradas com Dynabeads pré-ligado ao anticorpo que tenham sido previamente preparada como descrito acima. Pedra a mistura, além de a amostra de entrada de 50 mL, a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lave as contas com 1 mL do tampão de lavagem (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 0,5 M LiCl, 1mM EDTA, desoxicolato de sódio 0,7%, 1% NP-40). Então, use um suporte magnético para recolher as contas e remover o sobrenadante. Repita esta lavagem de 6 a 8 vezes. </li><li> Realizar uma lavagem final com 1 mL TE-plus-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). Girar a contas em uma microcentrífuga a 3.000 rpm por 2 minutos a 4 ° C. Após centrifugação, aspirar qualquer tampão TE residual. </li><li> Então, adicionar 100 mL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS) para as amostras. Imediatamente após, incubar as amostras a 65 ° C por 10 a 15 minutos. Zero os tubos contra um suporte para tubos de 1,5 ml a cada 2 minutos para manter as contas na suspensão. </li><li> Recolher as contas usando centrifugação e do suporte magnético, e transferir o sobrenadante para um tubo de PCR. Em seguida, recuperar a amostra de entrada salvo anteriormente e adicionar 3 volumes de tampão de eluição. </li><li> Finalmente, coloque o IP e amostras de entrada para o termociclador durante a noite a 65 ° C parainverter as ligações cruzadas. </li><li> No dia seguinte, adicione um volume de tampão TE para as amostras. Em seguida, adicione RNase A para uma concentração final de 0,2 mg / mL. Incubar as amostras no termociclador por 1 a 2 horas a 37 ° C. </li><li> Após a incubação, adicionar proteinase K para uma concentração final de 0,2 mg / mL. Então, incubar amostras no termociclador a 55 ° C por 2 horas. </li><li> Em seguida, extrair as amostras uma vez com um volume de fenol. Extrair as amostras uma segunda vez com um volume de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico. Finalmente, extrair as amostras mais uma vez com um volume de clorofórmio: álcool isoamílico. </li><li> Então, adicionar 30 mg de glicogênio para cada amostra. Além disso, adicionar NaCl para uma concentração final de 0,2 Molar e dois volumes de etanol para as amostras. Incubar por 30 minutos a -80 ° C. Após a incubação, as amostras de spin e decantar o sobrenadante. Lavar as pelotas com 500 mL de etanol 75%. Em seguida, secar o pellets e re-suspendê-las em 40 mL de água. </li><li> Para verificar os tamanhos dos fragmentos de DNA produzidos pelo processo de ultra-som, carga de 5 mg da amostra de entrada purificada em um gel de agarose 1,8% e correr o gel. O procedimento de sonicação deve produzir fragmentos na faixa de 150-350 pares de bases. No entanto, se os fragmentos não se enquadram nesta faixa, o procedimento de sonicação deve ser ajustada pela variação do número de rajadas ea amplitude. </li><li> Para verificar a robustez e especificidade do chip, o enriquecimento em regiões de controle de ligação através da realização de gene específico PCR com 1 ml de amostras de IP e uma série de diluição da amostra de entrada. Duas a três &quot;ligado&quot; regiões e uma região controlo independente precisam ser selecionados, a fim de testar a qualidade das amostras e IP de entrada. </li></ol> 5. Amplificação do DNA genômico <ol><li> Começando com 34 mL da amostra IP ou 200 ng da amostra de entrada, realizar o reparo final, &#39;A&#39; além da cauda e ligadura de adaptadores para fragmentos de DNA genômico utilizando DNA da amostra Prep Kit <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc., San Diego, CA). </li><li> Purificar o DNA através de um Kit de Purificação MinElute PCR e eluir em tampão EB (10 mM Tris Cl, pH 8,5) que tem sido pré-aquecido a 50 ° C. Por exemplo, usar 23 mL e 46 mL para a eluição final do IP e amostras de DNA de entrada, respectivamente. </li><li> Fazer a reação de PCR utilizando 23 mL de DNA com adaptadores, e 25 mL DNA polimerase Phusion do kit, 1 mL de 20 mM Sol_PCR_1, e 1 mL de 20 mM Sol_PCR_2. Executar a reação de PCR da seguinte forma: 1) 30 segundos a 98 ° C, 2) 10 segundos a 98 ° C, 3) 30 segundos a 65 ° C; 4) 30 segundos a 72 ° C; passos repetindo o passo 2-4 18 vezes e depois 5 minutos a 72 ° C, finalmente, segurando a 4 ° C. </li><li> Após amplificação por PCR, purificar o DNA com o Kit de Purificação QIAGEN MinElute PCR. Pré-aquecer mL EB 15 de buffer para 50 ° C e eluir o DNA. Diluir 0,5 mL da amostra 1:04 e realizar uma leitura Nanodrop. </li></ol> 6. Gel de purificação dos produtos amplificados <ol><li> Para purificar os produtos amplificados, preparar um gel de agarose 1,8% de 50 mL utilizando HPLC-grade água. Adicionar TAE e brometo de etídio após a agarose derreter. Em seguida, despeje o gel. Carregar o gel após a adição de 4 mL de tampão de carregamento para a entrada e amostras de IP. Em seguida, execute o gel em 120 volts por 45 minutos. </li><li> Analisar o gel depois que ele foi executado. O gel deve revelam que fragmentos na faixa entre 150 e 350 pares de bases são produzidos. Eles representam fragmentos de DNA genômico entre 50 e 250 pares de bases de comprimento e um adaptador. </li><li> Região, o consumo de gel contendo o material na faixa de 150 par 350 de base com um bisturi. Tome cuidado para evitar extirpar a banda adaptador adaptador, que roda a cerca de 120 pares de bases. Recuperar o DNA usando um QIAquick Kit Gel Extraction por instruções do fabricante. Especificamente, use uma coluna do Kit Gel Extraction QIAquick para uma fatia de gel de 400 mg ou menos. Para começar o processo de extração, adicionar 3 volumes de tampão QG para 1 volume de gel. Adicionar um volume de isopropanol e carregar a mistura na coluna. Use 0,5 ml de QG para lavar a coluna, seguido pelo procedimento padrão descrito no kit manual. Use H 2 O pré-aquecido a 50 ° C para eluir o DNA. Incubar a coluna com 30 mL de H 2 O, durante 5 minutos a 37 ° C antes de girar para baixo. </li><li> Secar a amostra até precisamente 11 mL em um Speedvac sem calor. Retire 1 mL da amostra e medir a concentração de DNA usando um espectrofotômetro Nanodrop. </li><li> Finalmente, identificar produtos enriquecidos com o gene AnalyzerIIe Genoma Illumina conforme descrito no <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>/ 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf 6. </li></ol> 7. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. O objetivo geral do experimento seguinte é identificar alvos genoma de KDM5A/JARID1A/RBP2 demetilase histonas. (P1) Isto é conseguido pela preparação de cross-linked cromatina que é sonicado para produzir fragmentos de DNA de tamanho apropriado. (P2) Como segundo passo, RBP2 fragmentos de DNA ligados são immunoprecipitated com RBP2 anticorpos. (P3) Em seguida, os fragmentos de DNA recuperado são reparados nas extremidades e adaptadores são ligados nas extremidades do DNA genômico para preparar bibliotecas de DNA genômico para análise sobre as células de fluxo na Estação Cluster Illumina. As bibliotecas de DNA são amplificados por PCR usando baixo número de ciclos. (P4) Por fim, Illumina seqüenciados curto lê são exclusivamente alinhados ao genoma humano, picos significativos são identificados e anotados para o próximo genes a fim de identificar RBP2 regiões enriquecido. (P5) Os resultados são obtidos que mostram funções moleculares associados com RBP2 genes alvo com base no genoma de identificação de regiões RBP2 enriquecido. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Verificar os resultados de sonicação cromatina Para verificar os tamanhos dos fragmentos de DNA produzidos pelo processo de sonicação, 5 mg (1 / 10) da amostra de entrada purificada foi carregado em 1,8% agarose gel. Como esperado, o nosso procedimento de sonicação produzido fragmentos na faixa de 150-350 bp. No entanto, se os fragmentos não se enquadram nesta faixa, o procedimento de sonicação deve ser ajustada em conformidade, variando o número de rajadas ea amplitude. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Gel de purificação dos produtos amplificados. Os produtos de PCR são executados em um gel para remover os adaptadores e selecione um tamanho gama de modelos para a plataforma de geração de cluster. Este gel mostra que fragmentos na faixa entre 150 e 350 pares de base foram produzidos. Eles representam fragmentos de DNA genômico entre 50 e 250 pares de bases de comprimento e um adaptador. Nós a região selecionada consumo de gel com um bisturi. Cuidados devem ser tomados para evitar a banda adaptador adaptador, que roda a cerca de 120 pares de bases. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Isoforma específica de anticorpos permite distinguir entre grandes e pequenos isoformas de RBP2. RBP2 estrutura da proteína é apresentado na vista de domínio. RBP2 contém vários domínios: o catalisador da histona desmetilação JmjC domínio e associados JmjN domínio, um domínio ÁRIDO capaz de sequências específicas de DNA de ligação, um dedo de zinco C5HC2 que potencialmente podem interagir com DNA ou outras proteínas, e vários domínios PHD. Os dois anticorpos anti-RBP2 que permitem distinguir entre RBP2 isoformas foram obtidos contra o RBP2 fragmentos indicadas por linhas grossas. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Figura 5a" /> Figura 5a. Visão geral do RBP2 regiões de ligação junto com cromossomos e genes Ensembl. Coordenadas de Genomic identificados enriquecido RBP2 (todas as isoformas e isoforma grande) regiões de ligação são apresentados cromossomo sábio. Occupances de genes Ensembl (versão 54; hg18) nos cromossomos (cromossomo 10 na foto) são apresentados como barras pretas (painel superior). Cada região RBP2 ligação é representada como uma linha vertical, onde o painel do meio mostra todas as isoformas RBP2 regiões de ligação no cromossomo 10, eo painel inferior mostra RBP2 regiões isoforma grande ligação. Meio e painéis de fundo dar visão geral de sobreposição e de ocupação específico de RBP2 isoformas no cromossomo 10. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Figura 5b" /> Figura 5b. Análise funcional de enriquecimento RBP2 genes-alvo. Mapa de calor mostrando FDR corrigido significativamente (p ≤ 0,05) enriquecido GO categorias Função Molecular entre os genes ligados (o mais próximo genes para a região RBP2 ligação) por RBP2 (isoformas todos e grande). As cores para vermelho indicam alta significância estatística, amarelo indica significância estatística baixa, e cinza indica que não há significância estatística. Análise de enriquecimento mostra a sobreposição de funções específicas e isoforma molecular dos genes RBP2 alvo.

<ol>
	<li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger.">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation.">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li><li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation.">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation.">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li><li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li><li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia.">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Diferenças funcionais entre RBP2 isoformas não foram determinadas. Temos usado uma abordagem abrangente para identificar regiões genômicas vinculado por RBP2 isoformas e definir as categorias funcionais que estas regiões representam. Isto foi conseguido por Chip-Seq análise bioinformática seguido por análise de seqüência obtida lê. RBP2 modifica metilado resíduos de lisina nas caudas das histonas. Descobrimos que RBP2 isoforma grandes contendo o módulo de reconhecimento de metilado isoforma lisina e RBP2 histona pequena sem este módulo para ligar as diferentes regiões do genoma humano (Figura 5A). Importante, isoforma específica regiões e regiões sobrepostas pertencem a genes com funções diferentes molecular (Figura 5B). Por exemplo, &quot;cromatina obrigatório&quot; e &quot;fator de transcrição de ligação&quot; funções podem ser atribuídas a metas de gene da isoforma RBP2 pequeno, mas não de grande RBP2 isoforma (Figura 5B). Comparando gene real conjuntos gerados para todas as isoformas e RBP2 isoforma grande (dados não mostrados), também podemos definir se a isoforma grande é especificamente recrutados para determinados genes.

Seqüências de oligonucleotídeos 2006 Illumina, Inc. Todos os direitos reservados. <ul><li> Sol_PCR_1 Seqüência 5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT ATC CCG T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Seqüência 5&#39;-CAA GGC GAC GAA GCA ATA CGA GCT CTT ATC CCG T-3 &#39; </li></ul>

genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets

Recrutamento de fatores de transcrição e epigenéticos para as suas metas é um passo fundamental na sua regulamentação. Em lugar de destaque no recrutamento são os domínios de proteínas que se ligam a determinadas modificações das histonas. Um domínio como é o homeodomínio planta (PHD), encontrado em várias proteínas de ligação da cromatina. O RBP2 fator epigenético tem vários domínios PHD, no entanto, eles têm funções diferentes (Figura 4). Em particular, o C-terminal PHD domínio, encontrado em uma fusão RBP2 oncogênico em leucemia humana, liga-se a lisina trimethylated 4 em H3 histonas (H3K4me3) 1. A transcrição correspondente à isoforma RBP2 contendo o PHD C-terminal se acumula durante a diferenciação de promonocytic, linfoma derivados, U937 células em monócitos 2. Consistente com ambos os conjuntos de dados, análise do genoma mostrou que em células U937 diferenciada, a proteína RBP2 é localizado para regiões genômicas altamente enriquecido para H3K4me3 3. Localização de suas metas para RBP2 correlaciona-se com uma diminuição na H3K4me3 devido à atividade RBP2 demetilase histona e uma diminuição da atividade transcricional. Em contraste, dois outros RBP2 DPSs são incapazes de vincular H3K4me3. Notavelmente, o C-terminal do domínio de PHD RBP2 está ausente no menor RBP2 isoforma 4. É concebível que a isoforma pequeno de RBP2, que carece de interação com H3K4me3, difere da maior isoforma na localização genômica. A diferença na localização genômica de RBP2 isoformas pode explicar a diversidade observada em RBP2 função. Especificamente, RBP2 é um jogador fundamental na diferenciação celular mediada pela proteína retinoblastoma (pRB). Consistente com esses dados, a análise do genoma anterior, sem distinção entre as isoformas, identificou dois grupos distintos de genes RBP2 alvo: 1) genes vinculados por RBP2 de uma forma que é independente de diferenciação; 2) genes vinculados por RBP2 em uma diferenciação forma dependente. Para identificar diferenças na localização entre as isoformas realizamos genome-wide análise de localização por Chip Seq. Utilizando anticorpos que detectam tanto RBP2 isoformas temos localizado todos os RBP2 alvos. Além disso, temos anticorpos que se ligam apenas grande, e não pequeno RBP2 isoforma (Figura 4). Depois de identificar os alvos isoforma de grande porte, pode-se então subtrair-los de todos os RBP2 alvos para revelar as metas da isoforma de pequeno porte. Esses dados mostram a contribuição de cromatina interagindo domínio no recrutamento de proteínas para seus sítios de ligação no genoma.

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Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.

Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

genome-wide-analysis-using-chip-to-identify-isoform-specific-gene

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K visualizações.  University of Illinois Chicago - UIC. Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Análise do genoma de Aminoacylation (carregamento) Níveis de tRNA Usando Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitativos e automatizada de alto rendimento de todo o genoma Telas de RNAi em C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel Bayesiana Algoritmo de Mudança-ponto para Genome-wide Análise de tipos de dados ChIPseq Diversos

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of limited use in exploring bacterial two component regulatory systems with uncharacterized activation conditions. Such systems regulate transcription only when activated in the presence of unique signals. Since these signals are often unknown, the in vitro microarray based method described in this video article can be used to determine gene targets and binding sites for response regulators. This DNA-affinity-purified-chip method may be used for any purified regulator in any organism with a sequenced genome. The protocol involves allowing the purified tagged protein to bind to sheared genomic DNA and then affinity purifying the protein-bound DNA, followed by fluorescent labeling of the DNA and hybridization to a custom tiling array. Preceding steps that may be used to optimize the assay for specific regulators are also described. The peaks generated by the array data analysis are used to predict binding site motifs, which are then experimentally validated. The motif predictions can be further used to determine gene targets of orthologous response regulators in closely related species. We demonstrate the applicability of this method by determining the gene targets and binding site motifs and thus predicting the function for a sigma54-dependent response regulator DVU3023 in the environmental bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

This video article describes an in vitro microarray based method to determine the gene targets and binding sites for two component system response regulators.

DNA-afinidade-purificada Método Chip (DAP-chip) para determinar genes alvos para bacteriana Dois Sistemas Regulatórios componentes

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).