Сила разгибателя коленного сустава является распространенным функциональным результатом, оцениваемым в клинических исследованиях. Однако методы многократной оценки мышцы разгибателя колена, особенно силы квадрицепса, в исследованиях на грызунах были относительно ограничены. Этот неинвазивный протокол может быть использован для измерения изометрического пикового тетанического крутящего момента коленных разгибателей у мышей и может повторяться продольно.
Наши методы поддерживают разработку доклинических моделей для улучшения восстановления после травм или у пациентов с остеоартритом. Учитывая широту моделей грызунов, разработанных для изучения результатов опорно-двигательного аппарата после травмы колена или остеоартрита, существует необходимость в неинвазивной оценке силы квадрицепса. Визуальная демонстрация имеет решающее значение для целостности данных, так как мы продемонстрируем, как оптимально разместить электроды для максимальной стимуляции коленных разгибателей.
Перед началом эксперимента убедитесь, что все машины подключены в соответствии со спецификациями производителя. Прикрепите двигатель с двумя мышцами нагрузки с помощью коленного удлинительного аппарата к платформе животного и включите водяной насос при 37 градусах Цельсия, затем включите компьютер, мощный двухфазный стимулятор и 2-канальный двухрежимный рычажную систему и добавьте изофлуран в испаритель до максимальной линии заполнения. Чтобы оптимизировать размещение зонда, в программном обеспечении прибора выберите Подготовить эксперимент и настроить мгновенную стимуляцию и установите частоту импульса 125 Гц, ширину импульса 0,2 метра в секунду, количество импульсов — один, частоту поезда — 0,5 Гц и время выполнения — 120 секунд.
Затем выберите Файл и откройте Монитор данных в реальном времени. Для проведения экспериментов с частотой подергивания и крутящего момента выберите ранее проведенное программное исследование, которое включает в себя соответствующие эксперименты с частотой подергивания и коленного удлинивания крутящего момента. Выберите подходящую экспериментальную мышь или Добавить новое животное и предоставьте соответствующую информацию о мыши, которая будет сохранена с данными крутящего момента.
Затем выберите Следующий эксперимент или Предыдущий эксперимент, чтобы перейти от протокола twitch к последовательности частот силы. После анестезии подтверждают спокоенность отсутствием реакции на педальный рефлекс и помещают мышь в лежачем положении на нагретой платформе с головой и носовым конусом. Используйте электрические кусачки, чтобы сбрить волосы с правой задней конечности.
После очистки волос от мыши и платформы плотно зажмите верхнюю заднюю конечность к колену. После зажима поместите нижнюю заднюю конечность в аппарат для разгибания колена с передней большеберцовой костью, слегка касаясь регулируемого пластикового куска, и оберните хирургическую ленту вокруг нижней части регулируемого пластикового куска, чтобы закрепить ногу на аппарате, затем отрегулируйте ручки на платформе, пока колено не будет согнуто под углом 60 градусов, и поместите кусок ленты на туловище мыши, чтобы предотвратить компенсаторное движение с максимальным разгибательным коленом. Поместите электрод подкожно на два-четыре миллиметра проксимально к колену непосредственно над квадрицепсами и мышцами разгибателя колена примерно на один-два миллиметра друг от друга.
Чтобы определить оптимальное размещение электродов, в программном обеспечении выберите Мгновенная стимуляция и Монитор живых данных и установите ток на 50 миллиампер для повторных подергиваний, чтобы подтвердить расширение, указанное отрицательной кривой подергивания. Чтобы достичь максимального крутящего момента при разгибаемом колене, отрегулируйте зонды, просматривая отклик в окне Live Data Monitor. При доставке повторных подергиваний с мгновенной стимуляцией пальпируют мышцы сгибателя колена мыши указательным пальцем, чтобы подтвердить, что активации мышц-антагонистов нет.
Для максимальной стимуляции разгибателя коленного сустава перепозиционирование зондов по мере необходимости. Когда оптимальное размещение зонда определено, установите ток на уровне 50 миллиампер и выберите «Выполнить эксперимент», чтобы произвести одно подергивание. Выберите «Анализировать результаты», чтобы отобразить выходной крутящий момент и записать крутящий момент подергивания, отображаемый в разделе «Максимальное усилие» с вычитанием базовой линии.
Повторите эксперимент, продемонстрированный до тех пор, пока крутящий момент подергивания либо не плато, либо не начнет уменьшаться. Увеличение тока до 10-20 миллиампер и регистрация крутящего момента подергивания для каждого эксперимента. Запишите самый низкий ток, при котором достигается самый высокий крутящий момент.
Этот ток будет использоваться для эксперимента с частотой силы. Чтобы определить пиковый изометрический тетанический эффект крутящего момента, выберите предпрограммный эксперимент с частотой крутящего момента для разгибания колена и установите продолжительность стимула 0,35 секунды, частотные последовательности — 10, 40, 120, 150, 180 и 200 Гц, а период покоя между импульсами и сокращениями — 120 секунд. Затем щелкните Запустить эксперимент и проанализировать результаты и вручную запишите крутящий момент на каждой частоте, убедившись, что силовой канал перевернут, поскольку сокращение разгибателя колена приведет к отрицательному крутящему моменту.
Обратите внимание на самое высокое значение максимальной силы как пиковый изометрический тетановый крутящий момент. В конце эксперимента с частотой крутящего момента выполните последующее подергивание и сравните последующее подергивание с начальным пиковым подергиванием при том же токе, чтобы оценить повреждение или усталость. Когда все измерения крутящего момента будут получены, аккуратно снимите электродные зонды и зажмите с колена и поместите мышь в рекуперационную клетку на теплоотводе с контролем до полного лежания.
В этом репрезентативном анализе три изолированных подергивания были введены при начальной стимуляции тока 10 Гц. Частичное слияние подергиваний наблюдалось при 40 Гц, а пиковый тетановый крутящий момент был достигнут при 120-180 Гц. В этом эксперименте кривые частоты крутящего момента разгибания колена были получены для трех мышей в нулевое время и через две недели после первоначальной оценки.
Как было замечено, исходные значения крутящего момента и необработанные значения крутящего момента, нормализованные для массы тела мыши, были статистически сходны в обеих временных точках, подтверждая воспроизводимость анализа. Как показано в этой области в рамках анализа кривой с использованием нормализованных изометрических данных крутящего момента массы тела для полных экспериментов с частотой крутящего момента для четырех отдельных мышей, аналогичный общий крутящий момент был получен после повторных анализов с теми же животными. Пиковый тетанный крутящий момент также продемонстрировал минимальную изменчивость внутри каждого животного.
Протокол пикового тетаничного крутящего момента коленного разгибателя коленного сустава является полезным инструментом для обнаружения различий в силе в нескольких моделях мышей. Например, в этом анализе можно наблюдать резкий контраст между силой разгибателя колена и не травмированной мышью дикого типа и трансгенной мышиной моделью супрафизиологической гипертрофии. Кроме того, почти 50%-ное снижение пикового крутящего момента наблюдалось у животных дикого типа через семь дней после хирургической трансекции передней крестообразной связки.
Оптимальное размещение электродов является неотъемлемой частью достижения значимых и воспроизводимых результатов. Усталость мышц коленного разгибателя является важным показателем физической функции, включая повторные субмаксимальные сокращения, и будущие оценки добавят дополнительную трансляционную значимость этому методу в доклинических моделях. В исследованиях, изучающих механизмы мышечной адаптации, часто используются мышиные модели из-за простоты генетической модификации.
Этот метод предлагает неинвазивный метод многократного измерения функции разгибателя коленного сустава in vivo в этих доклинических моделях.
