Este protocolo descreve uma técnica simples que pode ser usada para detectar a presença e medir o comprimento dos glicosaminoglicanos, que são moléculas de significado cada vez mais reconhecido para muitos processos biológicos. Esta técnica é prontamente adaptável à maioria dos laboratórios de ciências da vida. Técnicas glicómicas comparáveis muitas vezes requerem equipamentos e conhecimentos encontrados apenas em laboratórios de pesquisa de glicoquímica.
Essa técnica pode ser especialmente útil para pesquisadores interessados em estudar o glicocalyx, um revestimento de polissacarídeo que reveste as superfícies endotelial e epitelial do corpo humano. Comece colocando um vazio no tanque PAGE. Lance um gel de resolução misturando 10 mililitros de solução de gel de resolução com 60 microliters de persulfito de amônio recém-preparado em um tubo de 15 mililitros.
Em seguida, adicione 10 microliters de TEMED. Inverta o tubo suavemente duas a três vezes. Adicione rapidamente 10 mililitros da solução ativada de gel de poliacrilamida ao usando uma pipeta.
Sobreposição com dois mililitros de água filtrada deionizada, e permitir que o gel de resolução polimerize por 30 minutos. Depois que o gel de resolução tiver polimerizado completamente, descarte a água sobreposta. Lance o gel de empilhamento misturando três mililitros de solução de gel empilhante com 90 microliters de persulfito de amônio recém-preparado em um tubo de 15 mililitros.
Em seguida, adicione três microliters de TEMED e inverta o tubo suavemente duas a três vezes. Use uma pipeta para adicionar rapidamente a solução de gel de empilhamento sobre o gel de resolução solidificado até que o esteja cheio até a borda. Insira totalmente o pente incluído com o de gel poliacrilamida vazio e deixe o gel de empilhamento polimerizar por 30 minutos.
Uma vez polimerizado o gel, remova a tira de fita da parte inferior do e coloque o de volta no conjunto do tanque PAGE. Encha as câmaras superior e inferior com as respectivas soluções tampão. Dissolva amostras de glicosaminoglicano secos no volume mínimo necessário de água filtrada deionizada e misture com tampão de carga de amostra em uma proporção de um para um.
Coloque as amostras e as escadas de oligossacarídeo hs no gel. Pré-corra o gel por cinco minutos a 100 volts, em seguida, executá-lo a 200 volts por 20 a 100 minutos, dependendo da porcentagem de acrilamida da solução de gel de resolução. Uma vez que a corrida esteja completa, desmonte o e extraia cuidadosamente o gel em um grande recipiente limpo cheio de água filtrada deionizada.
Em seguida, descarte a água e manche o gel na solução de coloração azul alciano por cinco minutos. Descarte a mancha azul alciana e lave rapidamente duas a três vezes com água filtrada deionizada até que a maior parte da solução de coloração azul alciano tenha sido removida. Manche o gel na solução de coloração de nitrato de prata em um recipiente limpo fresco por 30 minutos.
Em seguida, lave duas a três vezes por 30 minutos cada em água filtrada deionizada para remover totalmente a solução de coloração de prata. Descarte a água e adicione a solução de desenvolvimento. Observe cuidadosamente o gel para a aparência de bandas.
Dependendo da qualidade da mancha e da massa da amostra carregada, o desenvolvimento pode levar de alguns segundos a vários minutos. Assim que as bandas desejadas estiverem visíveis, descarte imediatamente a solução em desenvolvimento e lave o gel brevemente com a solução STOP. Os glicosaminoglicanos isolados e purificados foram visualizados utilizando técnica de coloração azul alciana e prata após resolução dependente da densidade por uma eletroforese de gel de poliacrilamida.
Como visto nesta figura, os oligosacarídeos de sulfato heparan de diferentes comprimentos de polímero foram facilmente detectáveis usando esta abordagem baseada em PAGE. O limite de detecção desse método, tão baixo quanto 0,5 microgramas, mostra que a técnica é altamente sensível na detecção de glicosaminoglicanos isolados e purificados a partir de amostras biológicas. Dos quatro oligossacarídeos de sulfato de heparina diferentes visualizados usando este método, a heparina não fracriada foi menos facilmente detectável.
Devido à polidispersidade da heparina não fracedia, a densidade de cada banda individual desta amostra é menor do que as bandas produzidas por uma massa igual de oligossacarídeos de heparina purificada. A eficiência da purificação glicosaminoglicano a partir de amostras biológicas líquidas foi avaliada utilizando-se amostras de lavage broncoalveolar coletadas de camundongos, que originalmente continham concentrações relativamente baixas de glicosaminoglycanos. Além disso, o sucesso desta técnica foi demonstrado utilizando sulfato de heparina isolado de homogeneato pulmonar inteiro, o que rendeu uma grande quantidade de sulfato de heparina isolada, com os menores fragmentos igualando aproximadamente 10 subunidades descarcarída em massa.
É muito importante usar reagentes recém-preparados, e filtrar todos os reagentes usados neste protocolo. É fundamental usar reagentes da mais alta pureza e qualidade para executar com sucesso esta técnica.
