Este é um novo método de coloração de gel que utiliza uma sonda de prata fluorogênica para converter a coloração tradicional de prata em uma coloração de prata fluorescente. Este método mostrou melhor desempenho em comparação com a coloração convencional de nitrato de prata e coloração de Rubi SYPRO enquanto usava um protocolo simples e simples sem aldeídos. Demonstrando o procedimento estará Alex Wong, um assistente de pesquisa do meu laboratório.
Para iniciar este procedimento, diluir as amostras de proteína com uma solução contendo água destilada, tampão LDS e um agente redutor de amostras. Configure um mini tanque de gel cheio de buffer MES para executar o SDS-PAGE com um gel de proteína Bis-Tris de 4-12%. Carregue os poços com a amostra de proteína preparada e execute o gel a uma tensão constante de 200 volts por 30 minutos.
Após a eletroforese, submergir o gel em uma solução de 100 mililitros contendo etanol e ácido acético em um agitador orbital e incubar duas vezes por 30 minutos cada um em temperatura ambiente enquanto treme a 50 rpm. Em seguida, lave o gel três vezes com água ultrauso em um recipiente limpo com cada lavagem com duração de 10 minutos. Primeiro, dissolver 0,01 gramas de nitrato de prata em 10 mililitros de água ultrapura para preparar uma solução de estoque com uma concentração de 0,1%Adicione 100 microliters da solução de estoque em 100 mililitros de água ultrapura para fazer a solução de trabalho de nitrato de prata.
Em um capô de fumaça, submergir o gel em 100 mililitros da solução de trabalho de nitrato de prata em uma câmara de vidro selada. Use papel alumínio para proteger o gel da luz durante a impregnação e incubar por uma hora enquanto treme a 50 rpm em um agitador orbital. Depois disso, lave o gel duas vezes com água ultrauso em um recipiente limpo, com cada lavagem usando aproximadamente 100 mililitros de água e durando 60 segundos.
É importante usar água ultrauso para limpar o gel após a etapa de impregnação de prata para minimizar a coloração de fundo. Primeiro, adicione 50 mililitros de água ultrapura a três miligramas de corante TPE-4TA. Sonicar a solução por três minutos e adicionar cinco microliters de solução de hidróxido de sódio de um molar entre cada sessão de sônica para ajudar a dissolver o corante, geralmente até três vezes.
Em seguida, verifique a fluorescência da solução sob uma lâmpada UV de 365 nanômetros para garantir que o corante esteja totalmente dissolvido. Apenas soluções fracas ou não emissivas indicam dissolução total. Para preparar a solução de desenvolvimento fluorogênico, adicione 10 mililitros da solução de estoque TPE-4TA a 90 mililitros de água ultrauso.
Use um medidor de pH para verificar o pH da solução. Sintonize a solução a um pH entre 7 e 9, usando solução diluída de hidróxido de sódio ou ácido acético se o pH estiver fora de alcance. Em seguida, transfira o gel para um recipiente limpo e vedável com 100 mililitros da solução fluorogênica em desenvolvimento e certifique-se de que o gel esteja completamente imerso.
Sele o recipiente e cubra-o para protegê-lo da luz. Agite o recipiente durante a noite em um agitador orbital a 50 rpm e à temperatura ambiente. Transfira o gel para um recipiente limpo e desinto-lo em 100 mililitros de 10% de etanol por 30 minutos.
Em seguida, enxágue o gel em água ultrauso por cinco minutos. O gel pode ser visualizado em um transilluminador de bancada ou imageado em uma máquina de documentação de gel no canal de 365 nanômetros ou no canal de 302 nanômetros. Neste estudo, um novo método de coloração de prata fluorescente é usado para manchar proteínas em géis de poliacrilamida.
As faixas proteicas manchadas pela mancha de prata fluorescente exibem um verde intenso sob uma lâmpada UV de 365 nanômetros. Todas as 14 bandas de proteína são claramente visíveis e se correlacionam bem com as bandas de cor vermelha manchadas pelo corante SYPRO Ruby. Este método de coloração de prata fluorescente parece ter uma alta resolução.
Para algumas bandas proteicas, a sensibilidade da mancha de prata fluorescente também é ligeiramente melhor do que a da mancha fluorescente SYPRO Ruby. Em particular, o desempenho desta mancha é melhorado para as faixas proteicas entre 10 e 40 kilodaltons, o que indica que o novo método é particularmente útil para a detecção de proteínas com baixo peso molecular. Como se pode ver, os dados também sugerem que a mancha de prata fluorescente dá uma boa e uniforme linearidade para todas as 14 proteínas em uma gama relativamente ampla de quantificação proteica.
Enquanto a mancha de nitrato de prata deu um alto nível de sinal de fundo e picos distorcidos, a mancha de prata fluorescente detectou as bandas com bom contraste e distribuição de intensidade uniforme comparável à mancha de Rubi SYPRO em todas as 14 proteínas. As etapas de lavagem são importantes, pois limitam a solução de fixação residual de interromper a impregnação de prata ou o desenvolvimento fluorogênico. Ao usar nitrato de prata, evite o contato com a pele.
Limpe qualquer derramamento imediatamente. Use roupas de proteção e luvas e descarte como resíduos químicos.
