Os autores gostariam de agradecer a Dale Hirschkorn partir Systems Research Institute de sangue por sua ajuda com citômetro de fluxo configurações do instrumento. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL095470 e U01 HL072268 e contratos DoD W81XWH-10-1-0023 e W81XWH-2-0028.

NOTA: Os seguintes protocolos foram realizados em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Todas as amostras de sujeitos humanos foram testados no âmbito de um Conselho de Revisão Institucional (IRB) protocolo -aprovado e com o consentimento informado dos sujeitos. 1. MÉTODO A: Método de Detecção Pessoa 1.1) Processamento de Amostra de Sangue / Isolamento de EVs <ol><li> Extrair o sangue do dador / paciente em duas 10 ml de tubos de vidro contendo 1,5 mL de solução ACD-A ou outro anticoagulante adequado e processo imediatamente (dentro de 30 min-max), utilizando o protocolo de centrifugação diferencial 2-passo seguinte. NOTA: Este protocolo irá produzir aproximadamente 10 ml de plasma pobre em plaquetas (PPP) a partir dos combinadas ~ 17 ml de sangue extraído. Se mais ou menos PPP é necessário, o número de tubos de sangue recolhida pode ser ajustada em conformidade. </li><li> Centrifugar as amostras a 1500 xg durante 10 min a RTpara separar o plasma de buffy coat e glóbulos vermelhos. Transferir alíquotas de 1,2 ml do sobrenadante do plasma para tubos de 1,5 ml de centrífuga, tendo o cuidado de não perturbar as camadas do fundo contendo o buffy coat e glóbulos vermelhos. </li><li> Girar a 13.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente para remover plaquetas e fragmentos celulares grandes. Transferir cuidadosamente o PPP, deixando para trás 200 mL para evitar perturbar o sedimento e adicionar o PPP para um novo tubo. </li><li> Neste ponto, usar PPP imediatamente para análise ou transferência em alíquotas de 1,0 ml a 1,5 ml novos tubos de centrífuga e armazenar a -80 ° C por até dois anos, para posterior análise (consulte a Figura 1A para visão geral). </li><li> Se forem necessários VE purificados por experiências de transferência funcionais, 6 ml de PPP para um tubo de ultracentrífuga e adicionar 28 ml de salina tamponada com fosfato 0,2 micrometros de filtrado (PBS). Centrifugação durante 60 min a 100000 xg, à temperatura ambiente, usando uma ultracentrífuga equipado com um rotor de balde oscilante. Aspirar sobrenadante e ressuspender EV peldeixe em 1,5 ml de mídia. NOTA: Para obter mais alta reprodutibilidade, amostras de sangue devem ser tratados de forma tão consistente quanto possível, do doador ao doador. Qualquer variação no método de isolamento de EV poderia impactar significativamente o número e tipo de EVs detectadas. </li></ol> 1.2) A preparação de amostras para análise NOTA: A partir deste ponto, os passos explicar um protocolo de alto rendimento para a análise de 12 amostras por 14 marcadores em 3 painéis. No entanto, outras combinações de anticorpos podem ser usados ​​aqui; o protocolo pode ser adaptado para estudar outras populações EV substituindo os marcadores sugeridas por aqueles de interesse. <ol><li> Retirar amostras de 12 congelador (se armazenados a -80 ° C) e descongelação a 37 ° C. </li><li> Conteúdo da pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar. Remover 320 mL de cada amostra e adicionar ao topo da linha de uma placa de 96 poços. NOTA: A largura ajustável multi-bem pipeta é extremamente útil para este e muitos outros passos em todo o burroay, particularmente quando se analisam amostras múltiplas de uma só vez. </li></ol> 1,3) As amostras de coloração EV <ol><li> Antes da coloração, filtrar todos os anticorpos (Abs) para remover os agregados, o que pode causar sinais positivos. <ol><li> Anticorpos combinam para ser utilizado em cada um dos três painéis separados em tubos de filtro de 0,22 um e centrifugar centrífugos usando um ângulo fixo única centrífuga de velocidade (~ 750 x g) à temperatura ambiente durante 2 minutos, ou até que toda a mistura Ab tenha passado através do filtro e o líquido não anticorpo permanece na superfície do filtro. Loja Ab cocktails na geladeira por até duas semanas, mas re-filtro antes de cada utilização. </li></ol></li><li> Adicionar a quantidade apropriada de mistura Ab filtrou-se para cada poço na fila 2 (por exemplo, no painel de amostras I são coradas com 2 ul de cada Ac, então um total de 12 ul de Ab cocktail filtrado é adicionado por poço com a linha 2). Consultar a Figura 1B para um esboço da placa mapa sugerido. Repita estes dissos para as linhas abaixo se mais painéis são executados (aqui, adicionar 8? l / poço do cocktail Painel de acordo com a linha II 3 e 11 ^ l / poço do cocktail Painel de acordo com a linha III 4 referem-se a Lista de Materiais para a informação de painel específico). </li><li> Usando a pipeta multicanal, misturar as amostras de PPP na linha 1 para cima e para baixo e transferir 100 ul dos poços na linha 1 para os poços em linha 2. Mix cima e para baixo. Alterar dicas e repetição, transferindo 100 l da linha 1 para as linhas 3 e 4. Incubar a 4 ° C por 30 min. </li></ol> 1.4) As amostras de lavagem de MT <ol><li> Remova a placa de 96 poços a partir de 4 ° C e a transferência câmara de segurança biológica. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 220 ul de PBS / poço para linhas 6-8 (para ser utilizado na limpeza / lavagem dos poços contendo manchado PPP). </li><li> Transferir o conteúdo de cada cavidade para tubos centrífugos de filtro pré-marcado, utilizando a pipeta multicanal largura-ajustável (Para 12 amostras, com três painéis de anticorpos, 12 x 3 = 36 tubos de filtroser necessária). Usando as mesmas pontas, remover 200 ul de PBS a partir das linhas de lavagem e adiciona-se aos poços correspondentes a partir do qual apenas PPP foi removido. </li><li> Misturar cima e para baixo para lavar os poços e transferir a solução de enxaguamento para os mesmos filtros para que o PPP foi adicionada previamente. Fechar topos de filtros centrífugas. Alterar dicas. </li><li> Repita este processo com as amostras manchadas restantes até que todas as amostras de PPP manchadas foram transferidos junto com suas soluções de lavagem de filtros centrífugos. </li><li> Transferir os filtros centrífugos para uma centrifugadora de rotor fixo e centrifugação a 850 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. NOTA: Certifique-se de que nenhum líquido permanece nos topos de filtro. Após centrifugação, o filtro deve parecer &quot;seca&quot; sem camada de fluido restante visível na parte superior. Embora seja improvável, determinadas amostras de PPP pode exigir um longo tempo de centrifugação para se mover de forma eficaz através do filtro. </li><li> Retire os tubos de filtro centrífugo e retornar à câmara de segurança biológica.Utilizando a pipeta multicanal, ressuspender as partes superiores dos filtros em 300 ul de PBS. Transferir o conteúdo em suspensão para tubos pré-marcado para análise FCM imediato. NOTA: É muito importante manter a força e número de depressões pipeta êmbolo consistentes entre as amostras para evitar variação de amostra para amostra. Isto deve idealmente ser feito usando uma pipeta eletrônica que foi programado para pipeta cima e para baixo um volume específico (por exemplo, 280 ul) um número exato de vezes (por exemplo, oito vezes) para cada amostra. </li></ol> 1.5) Setup Cytometer <ol><li> Abra o software FCM. Antes de experimentar a instalação, execute a calibração do aparelho diariamente e configuração usando esferas de Instalação instrumento (seguindo as instruções do fabricante). </li><li> Se as amostras EV foram coradas com mais do que um anticorpo e vários fluorocromos que devem ser medidos ao mesmo tempo, calcular valores de compensação, como segue: <ol><li> Adicione 2 gotas de esferas de compensação para prétubos (marcado com um tubo para cada anticorpo conjugado com fluorocromo) e adicionar a quantidade recomendada de anticorpos. Adicione 2 gotas de esferas de compensação negativas para outro tubo para usar como o controlo de compensação unstained. </li><li> Incubar a 4 ° C durante 30 minutos, lava-se com PBS e ressuspender em 400 ul de PBS. </li><li> Usando o citômetro de fluxo software incluído com o instrumento, execute cada tubo de compensação e ajustar tensões fluorescentes para colocar cada pico em aproximadamente 10 4 em uma escala log 5 décadas. Certifique-se que o pico de fluorescência é maior (mais brilhante) em seu próprio canal fluorescente em comparação com todos os outros canais, e ajustar as tensões dos parâmetros fluorescentes novamente se necessário. Execute cada tubo comp-coradas individualmente e capturar pelo menos 5.000 eventos por tubo. </li><li> Selecione a opção &quot;Experiment&quot;, guia, em seguida, selecione &quot;Compensação&quot;, em seguida, selecione &quot;o cálculo das compensações&quot; para aplicar os valores de remuneração para todas as amostras. </li></ol></li><li&gt; Definir a dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) parâmetros de tensão a escala logarítmica e escolha os limites inferiores permitidas pelo citômetro (FSC = 200 e SSC = 200) para cada um. </li><li> Durante a execução de um tubo de 0,22 filtrada PBS, ajustar as voltagens do FSC e SSC para os maiores valores que excluem a maioria dos ruídos de fundo (ou seja, um pouco abaixo do limiar de tensão em que a taxa de eventos ultrapassa 5 eventos / seg). </li><li> Em seguida, executado um tubo contendo 0,2 mm - 1,0 mm os grânulos, diluídas em PBS, se necessário. Em uma trama FCS vs. SSC, desenhe um portão em torno da população de esferas para capturar eventos entre 0,2 m e 1,0 m. Em alternativa, em um histograma SSC-H, desenhe um portão para incluir todos os eventos menores do que os 1,0 mm esferas. </li><li> Ajustar a taxa de fluxo do citômetro de &quot;Lo&quot; (cerca de 8-12 l / min). Usando o tubo de esferas (ou outro tubo contendo uma concentração conhecida de contas) ajustar a taxa de fluxo de marcação no citómetro até a vésperant taxa atinge cerca de 200 eventos / seg. Ler todos os tubos de amostra com a mesma taxa de fluxo e utilizar a mesma concentração do grânulo em experiências futuras para assegurar que as taxas de fluxo permanecem consistentes entre corridas. </li><li> Executar um tubo de partículas fluorescentes do arco-íris, diluídos em PBS. Adquirir 5.000 eventos. Registre os valores da intensidade média do FSC, SSC, e cada canal de cor. Use esses valores para ajustar tensões em experimentos futuros para garantir que a intensidade de fluorescência de manter a coerência entre os experimentos. </li></ol> 1.6) A leitura das amostras <ol><li> Ajustar a taxa de fluxo do citômetro de &quot;Lo&quot; (cerca de 8-12 l / min) e executar cada amostra para exatamente 1 ou 2 min. </li><li> Após a primeira leitura, adicionar 20 ul de 10% de NP-40 a cada amostra, pipeta cima e para baixo, e voltar a ler para o mesmo período de tempo (1 ou 2 minutos) para permitir a subtracção de eventos positivos detectados em a amostra lise sobre um período de tempo igual. NOTA: É extremamente important que as amostras sejam misturadas utilizando uma pipeta, em vez de um vórtex. Em nossa experiência, vórtex pode causar auto-agregação de alguns anticorpos, levando a eventos positivos que imitam EV. </li><li> Uma vez que todas as amostras foram lidos, exportação de todos os arquivos .fcs em um arquivo separado para ser usado para análise utilizando o software de análise FCM. </li></ol> 1.7) Análise de Dados <ol><li> Abra o software de análise FCM. Importe todos os arquivos .fcs em um novo arquivo experimento. </li><li> Abra o beads-somente tubo. No FSC-A vs. SSC-A trama, desenhar uma porta em torno todos os tamanhos esferas entre 0,2 mm e 1,0 mm. Esta é a porta EV. Arraste para adicionar a todas as amostras. </li><li> Utilizando as amostras lisadas como controlos negativos, desenhar portas na extremidade de fundo de fluorescência em cada canal de fluorescência utilizado. Arraste portões fluorescentes no portão EV de cada amostra não-lisadas correspondente. NOTA: Neste ponto, ele também é útil para examinar duas parcelas bi-parâmetro fluorescentes. Formas de foguetes emo quadrante duplo positivo (ver Figura 8), particularmente se os marcadores são conhecidos a residir em tipos de células não relacionadas, podem ser indicativos de artefacto de agregação ou outros eventos que mimetizam a vesícula. </li><li> Para cada marcador fluorescente, subtrai-se o número de eventos na amostra lisadas a partir do número de eventos na amostra não-lisadas. Opcionalmente, dividir esse número pelo número total de EVs dentro do portão não-lise EV obter% valores positivos. </li></ol> 2. Método B: Método Beads 2.1) Processamento de Amostra de Sangue / Isolamento de EVs <ol><li> Consulte o método de processamento de sangue descrito no Método A (Seção 1.1). </li></ol> 2.2) A preparação de amostras para análise <ol><li> Se desejar, fracionar PPP ou EVs ultracentrifugado em exossomos e microvesículas. Adicionar 250 mL de PPP ou EVs ultracentrifugado para 0,22 filtros centrífugos e transferir para uma centrífuga de rotor fixo e rotação a 750 xg durante 2 min à temperatura ambiente. NOTA: Certifique-se de que nenhum líquido permanece nos topos de filtro. Após centrifugação, o filtro deve parecer &quot;seca&quot; sem camada de fluido restante visível na parte superior. Embora seja improvável, certas amostras podem requerer um tempo ligeiramente mais longo por centrifugação o fluido a mover-se de forma eficaz através do filtro. </li><li> Lave não revestidos 6 mm esferas de poliestireno (por exemplo, contas negativas ABC) 2x com meio RPMI e ressuspender em 2 ml. Adicionar 6000 grânulos para cada tubo de FACS. Para o tubo de controlo negativo, adicionar 400 ul de meio RPMI sozinho para os grânulos. Para todos os outros tubos, adicionar 200 mL de PPP ou EVs ultracentrifugado (ou suas fracções) e 200 mL de meio RPMI. </li><li> Ajustar o volume final de todos os tubos para 400 ul com meio e incubar durante a noite a 4 ° C num agitador. </li><li> Na manhã seguinte, lavar os grânulos com 2 ml de meio. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Bloco com 5% de albumina sérica bovina (BSA) em meios (400 mL) durante 3 horas a 4 &amp;# 176; C em um shaker. </li><li> Lavar as pérolas com 2 ml de meio. Aspirar e ressuspender o sedimento em 100 ul de meio. </li></ol> 2.3) As amostras de coloração EV <ol><li> Filtro de todos os anticorpos. Usar os mesmos painéis de anticorpos utilizados no Método A, ou se desejado, criar uma combinação diferente de anticorpos, desde que as suas fluorocromos são compatíveis um com o outro. </li><li> Combine todos os anticorpos a ser utilizados num único painel para um tubo de centrífuga de filtro de 0,22 um. Centrifugar usando um ângulo fixo de centrífuga de velocidade única durante 2 minutos ou até toda a mistura Ab tenha passado através do filtro e nenhum líquido anticorpo permanece na superfície do filtro. </li><li> Adicionar o volume apropriado da mistura de anticorpos filtrada para todos os tubos e incubar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as pérolas com 2 ml de meio, ressuspender em 400 ul de meio e executar imediatamente (ou no mesmo dia) no citómetro de fluxo. </li></ol> 2.4) Cytometer Setup e Sample Reading<ol><li> Abra o software FCM. Antes de experimentar a instalação, execute a calibração do aparelho diariamente e configuração usando esferas de Instalação instrumento (seguindo as instruções do fabricante). </li><li> Se as amostras EV foram coradas com mais do que um anticorpo e vários fluorocromos que devem ser medidos ao mesmo tempo, calcular valores de compensação, como segue: <ol><li> Adicione 2 gotas de esferas de compensação para tubos pré-marcados (1 tubo para cada anticorpo conjugado com fluorocromo) e adicionar a quantidade recomendada de anticorpos. Adicione 2 gotas de esferas de compensação negativas para outro tubo para usar como o controlo de compensação unstained. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos, lava-se com PBS e ressuspender em 400 ul de PBS. </li><li> Usando o software FCM, execute cada tubo de compensação e ajustar tensões fluorescentes para colocar cada pico em aproximadamente 10 4 em uma escala log 5 décadas. Certifique-se que o pico de fluorescência é maior (mais brilhante) em seu próprio canal fluorescente em comparação com todos os outros canais, eajustar os parâmetros de tensões fluorescentes novamente, se necessário. Execute cada tubo comp-coradas individualmente e capturar pelo menos 5.000 eventos por tubo. </li><li> Selecione a aba &quot;Experiment&quot;, depois &quot;Compensação&quot;, então &quot;o cálculo das compensações&quot; para aplicar os valores de remuneração para todas as amostras. </li></ol></li><li> Alterar o FSC e SSC parâmetros de tensão a escala logarítmica e escolha os limites inferiores permitidas pelo citômetro (FSC = 200 e SSC = 200) para cada. </li><li> Amostras de correr, portão sobre a população pérolas singlet e adquirir 2.000 eventos neste portão. Exportar arquivos .fcs. </li><li> Use um software de análise FCM para analisar .fcs arquivos. Portão em esferas singletos. Calcular a intensidade fluorescente média geométrica (IMF) para cada fluorocromo e comparar com o MFI do controlo negativo. </li></ol>

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M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles.">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li><li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry.">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li><li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles.">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li><li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+(Cell-Derived+Microparticle)+Signatures+in+Joint+Diseases.">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., M&#243;dos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters.">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response:+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling.">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li><li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles:+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it.">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li><li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

Os autores não têm qualquer conflito de interesse de divulgar.

Dois diferentes protocolos para o isolamento, tratamento e análise de VE foram apresentados, utilizando quer uma individual de detecção ou de aproximação baseadas em esferas. Selecionando o método mais adequado para usar nem sempre é fácil e requer uma compreensão da amostra a ser testada, bem como as subpopulações de interesse individuais. Além disso, a sensibilidade do citómetro usado para a aquisição deve ser considerado quando se escolhe o método mais adequado. Muitas vezes não há melhor protocolo ...

Vesículas extracelular (VE) são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que são altamente envolvido na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos. Análise de EVs usando citometria de fluxo (FCM) tem sido notoriamente difícil devido ao seu pequeno tamanho e falta de populações discretas positivas para os marcadores de interesse. Métodos de análise EV, enquanto melhorou consideravelmente na última década, ainda são um trabalho em andamento. Infelizmente, não há one-size-fits-all protocolo, e vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Apresentado aqui estão várias técnicas diferentes para o processamento de EVs e dois protocolos para a análise de EVs usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão. Os métodos descritos aqui vai ajudar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontrados em preparações comerciais, aumentando a relação sinal-ruído, e portões configuração em um f racionalashion que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. O primeiro protocolo utiliza um método individual de detecção que é especialmente adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada no grânulo para capturar e detectar os VE e exossomas menores. VE, também conhecidos como micropartículas, são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que estão envolvidos na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos 1. Através da expressão de vários marcadores de superfície e / ou a transferência directa de material biológico, VE é capaz de alterar a função das células receptoras para jogar ou activação ou supressão de funções na comunicação intercelular 2-4. VE, derivados de plaquetas Clinicamente são conhecidas por terem forte actividade anticoagulante 5, enquanto outros têm sido mostrados para contribuir para uma vasta gama de condições, de promoção do tumor metastasis 6 a proteger contra a doença 7. EVs podem ser classificados em categorias menores de vesículas derivadas de células, tais como exossomos e microvesículas (MVs), dependendo do seu tamanho e do mecanismo da geração 8. A nomenclatura de subpopulações de vesículas derivadas de células continua a ser um tema de debate em curso 8,9, no entanto, exossomos são geralmente descritos como pequena, 40 a 100 nm partículas derivadas da fusão endosomal com a membrana plasmática, enquanto MVs são maiores de 100 a 1.000 partículas nm formado por derramamento da membrana plasmática 10. Aqui, o termo geral &quot;EVs&quot; será usado para se referir a todos os tipos de vesículas extracelulares biológicos liberadas pelas células. Isolamento de VE de sangue total é um processo multi-passo e muitas variáveis ​​de processamento diferentes têm sido demonstrado que afectam o conteúdo EV, incluindo a temperatura e duração de armazenamento 11,12, anticoagulante / conservante utilizado e 13método de centrifugação usado 14. A necessidade de padronização dessas variáveis ​​levou a recomendações da Sociedade Internacional sobre Trombose e processamento de sangue e isolamento EV procedimentos Haemostasis Comité Científico e Normalização (ISTH SSC) para o bom 15,16, ainda não existe um consenso entre os pesquisadores sobre o protocolo ideal usar 12. A maioria concorda, no entanto, que as variáveis ​​pré-analíticas rigidamente controladas são cruciais para a dados precisos e reprodutíveis. A fim de analisar EVs, os pesquisadores têm utilizado vários métodos, incluindo microscopia eletrônica de transmissão 17, microscopia eletrônica de varredura 18,19, microscopia de força atômica, luz dinâmica de espalhamento 20,21 e western blot 22,23. Enquanto FCM é o método de escolha para muitos pesquisadores 9,24 - 26, devido às suas capacidades de alto rendimento, a análise de EVs usando FCM tem sidonotoriamente difícil devido ao seu tamanho e falta de populações positivas discretas 27-32. Em comparação com a análise de células, o tamanho pequeno das EVs resulta em 1) menos fluorescência emitida, devido ao menor número de antigénios por partícula e 2) viabilidade limitada de lavagem pós-mancha, a qual é necessária para reduzir a fluorescência de fundo. Desafios comuns entre os pesquisadores incluem sinais decorrentes de agregados de imunoglobulinas 27,28 e auto-agregação de anticorpos 29. Além disso, os tempos de processamento longos e procedimentos de lavagem / isolamento morosos utilizados por muitos dos protocolos actuais requerem 33,34 compromissos de tempo de vários dias para analisar um pequeno número de amostras, tornando-os menos do que ideal para aplicações de alto débito. Alguns pesquisadores renunciar a um passo de lavagem por completo, tornando tradicionalmente utilizados controles negativos FCM como uma fluorescência menos (FMO) e isotipos de anticorpos inútil para avaliar com precisão bacfluorescência kground 30. Nossos protocolos de enfrentar três problemas comuns que podem impedir a análise FCM adequada de EVs: Os sinais resultantes de agregados de anticorpos e outros não-vesículas, dificuldade em remover o anticorpo não ligado, e falta de populações positivos discerníveis. As técnicas descritas aqui irão auxiliar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontradas em preparações comerciais, o aumento da razão sinal-para-ruído, e definindo portões de uma forma racional, que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. Dois métodos diferentes de detecção são aqui apresentados: o primeiro protocolo utiliza um método de detecção individual que é especialmente bem adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada em grânulos para capturar e detectar os VE e exossomas menores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >LSR II benchtop flow cytometer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS Diva software&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >PC version 6.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJo software&#160;</td>
			<td >Treestar US</td>
			<td ></td>
			<td >Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphero Rainbow fluorescent particles</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >556298</td>
			<td >used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra Rainbow fluorescent particles&#160;</td>
			<td >Spherotech</td>
			<td >URFP-10-5</td>
			<td >used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Megmix-Plus SSC beads</td>
			<td >Biocytex</td>
			<td >7803</td>
			<td >used to adjust FSC and SSC&#160; voltages to maintain&#160; consistency&#160; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AbC Anti-Mouse Bead Kit</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-10344</td>
			<td >used for compensation controls &#38; negative AbC beads used for beads-based method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td>
			<td >Santa Cruz&#160;</td>
			<td >sc-281108</td>
			<td >used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD TruCOUNT Tubes</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340334</td>
			<td >used whenver absolute EV concentrations are needed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrafree-MC, GV 0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td >Millipore&#160;</td>
			<td >UFC30GVNB</td>
			<td >used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >364606</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Facs tubes 12x75 polystrene</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >352058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Reservoirs individually wrapped&#160;</td>
			<td >Phenix</td>
			<td >RR-50-1s</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips - 10&#181;L</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L10S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips -200&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L250S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green -Pak pipet tips - 1000&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L1000S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stable Stack L300 tips presterilized</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >SS-L300S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet-Lite&#160;XLS 8 Channel LTS&#160;Adjustable&#160;Spacer&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >LA8-300XLS</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td >E&#38;K Scientific</td>
			<td >EK-20180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Media (without Hepes)</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAE001</td>
			<td >media used for bead-based detection method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2&#181;m filtered</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAL003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td>
			<td >BECKMAN COULTER INC</td>
			<td >344058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL I</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 PerCP-Cy5.5</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >344808</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD14 APC-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301820</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD16 V450</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560474</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >302906</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD152 APC</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555855</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD19 A700</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >302226</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL II</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD41a PerCP-Cy5.5</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340930</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62L APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304810</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD108 PE&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >552830</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD235a FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >349104</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL III</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD11b PE-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301322</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62p APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304910</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD66b PE&#160;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >305106</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD15 FITC</td>
			<td >exalpha</td>
			<td >X1496M</td>
			<td >5 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD9 PE</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >555372</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD63 APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >353008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC-Cy7 Ms IgG2a, &#954;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >400230</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

Vesículas extracelular (VE) são pequenas, vesículas derivadas de membrana encontrados nos fluidos corporais que são altamente envolvido na comunicação célula-célula e ajudam a regular uma variada gama de processos biológicos. Análise de EVs usando citometria de fluxo (FCM) tem sido notoriamente difícil devido ao seu pequeno tamanho e falta de populações discretas positivas para os marcadores de interesse. Métodos de análise EV, enquanto melhorou consideravelmente na última década, ainda são um trabalho em andamento. Infelizmente, não há one-size-fits-all protocolo, e vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Apresentado aqui estão várias técnicas diferentes para o processamento de EVs e dois protocolos para a análise de EVs usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão. Os métodos descritos aqui vai ajudar com eliminando os agregados de anticorpos normalmente encontrados em preparações comerciais, aumentando a relação sinal-ruído, e portões configuração em um f racionalashion que minimiza a detecção de fluorescência de fundo. O primeiro protocolo utiliza um método individual de detecção que é especialmente adequado para a análise de um grande volume de amostras clínicas, enquanto que o segundo protocolo utiliza uma abordagem baseada no grânulo para capturar e detectar os VE e exossomas menores.

<html> A Figura 1 apresenta o esquema de tratamento global para o isolamento e detecção de veículos eléctricos, utilizando quer o método baseado em grânulo ou método de detecção individual. Detecção individual de EVs usando FCM funciona bem para a análise de EVs maiores, mas a maioria dos cytometers não são capazes de detectar individualmente partículas tão pequenas como exossomos. Uma abordagem baseada em grânulo permite VE pequenas para serem detectados, no entanto, existem desvantagen...

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Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Existem muitos métodos diferentes para a medição de vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometria de fluxo (FCM). Vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Dois protocolos de VE de medição são apresentadas, usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão.

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K visualizações.  Blood Systems Research Institute.  Existem muitos métodos diferentes para a medição de vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometria de fluxo (FCM). Vários aspectos devem ser considerados para determinar o método mais adequado para usar. Dois protocolos de VE de medição são apresentadas, usando detecção individual ou uma abordagem baseada no talão. 

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Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biologia

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow - Combinando optogenética com Citometria de Fluxo

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and first-generation particle analysis to comprehensive multi-parameter measurements such as nano-flow cytometry (nFCM). nFCM is a form of flow cytometry that utilizes instrumentation specifically designed for nano-particle analysis, allowing for thousands of EVs to be characterized per minute both with and without the use of staining techniques. High resolution side scatter (SS) detection allows for size and concentration to be determined for all biological particles larger than 45 nm, while simultaneous fluorescence (FL) detection identifies the presence of labeled markers and targets of interest. Labeled subpopulations can then be described in quantitative units of particles/mL or as a percentage of the total particles identified by side scatter.
Here, EVs derived from conditioned cell culture media (CCM) are labeled with both a lipid dye, to identify particles with a membrane, and antibodies specific for CD9, CD63, and CD81 as common EV markers. Measurements of comparison material, a concentration standard and a size standard of silica nanospheres, as well as labeled sample material are analyzed in a 1-minute analysis. The software is then used to measure the concentration and size distribution profile of all particles, independent of labeling, before determining the particles that are positive for each of the labels.
Simultaneous SS and FL detection can be utilized flexibly with many different EV sources and labeling targets, both external and internal, describing EV samples in a comprehensive and quantitative manner.

The latest generation of EV characterization tools are capable of single EV analysis across multiple parameters simultaneously. Nano-flow cytometry measures all biological particles larger than 45 nm without labeling and identifies specific characteristics of subpopulations by a variety of fluorescent labeling techniques.

Caracterização da Proteína Transmembrana da Vesícula Extracelular Única por Citometria de Nanofluxo

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...