Vesículas extracelulares estão sendo cada vez mais utilizadas como biomarcadores diagnósticos e potencial ferramenta terapêutica em muitos campos. Flow Cytometric é o método analítico mais direto para caracterizar por marcadores de terno este protocolo pode ser usado na análise de uma partícula assized, é rápido e é aplicável a sismômetros convencionais sem a necessidade de configuração especial ou o instrumento dedicado. Embora este protocolo seja usado para categorizar vesículas extracelulares a partir dessa condição e meio, ele pode ser expandido para a categorização de AVs de sangue que chegou, para substituir biópsias tecidivas invasivas em pacientes.
Para os pesquisadores novos no protocolo, é fundamental realizar etapas descritas na seção de método de configuração, e acompanhar de perto as estratégias de obtenção demonstradas Comece por revestir 55 centímetros de petri-pratos quadrados com gelatina de pele 02%, em PBS. Após 15 minutos, lave o prato e a placa 4,4 vezes 10 para o quinto progenitor cardíaco em cada prato em 7 mililitros do Medium modificado de Iscove, ou IMDM, complementado com soro bovino 20% fetal, e 1%penicilina e estreptomicina para sua incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingem cerca de 80% de confluência, lave as culturas duas vezes com a PBS de Dulbecco sem cálcio e magnésio e alimente as células com 10 mililiters de meio de produção exossomo livre de soro.
Após 7 dias, acumule o meio condicionado de cada placa, em um único tubo de centrífugas de polipropileno e centrifugar o meio para remover quaisquer detritos celulares. Transfira o supernacente para um tubo filtro de centrífugas de centrífugas de 100 quilodalton, e concentre o meio limpo, condicionado, com uma centrifugação adicional. Transfira o concentrado para um tubo de micro centrífuga para uma centrifugação final do banco e adicione o supernacente em um tubo micro centrífugas de parede grossa de policarbonato.
Encha o tubo com PBS, a um volume final de 3,2 mililiters, e carregue a amostra em um rotor de titânio fixo. Em seguida, carregue o rotor em uma ultracentragem de mesa para ultracentrifugação, e resuspenja a pelota em 100 microliters de PBS fresco. Para quantificação e análise de nanopartículas, diluir 1 microliter da amostra ultracentrifada, em 999 microliters de PBS, e carregar a amostra em uma seringa de 1 mililitro sem bolhas.
Carregue a seringa na porta de entrada da câmara de exame e ligue o laser. Use o botão de captura para abrir a câmera e ajuste o foco. Em seguida, grave pelo menos três quadros diferentes de 60 segundos cada, e use a opção de processo de lote no software, para analisar as três aquisições diferentes.
Para preparar a amostra para aquisição, adicione primeiro as contas de captura conjugadas de anticorpos monoclonais experimentais apropriados em uma proporção de 1:1:1, em um tubo de micro centrífuga, e vórtice a piscina de contas de captura resultante. Em seguida, adicione o volume apropriado de amostra a 1 microliter de pool de contas de captura para gerar um 1 vezes 10 para as 8 partículas mais 1,2 vezes 10 para as 5ª contas por concentração de teste. Adicione 1 microliter de contas a um tubo rotulado como controle negativo, e ajuste o volume em cada tubo para 100 microliters com PBS fresco.
Em seguida, coloque os tubos em uma batedeira térmica, com agitação, a 400 rotações por minuto, e 4 a 10 Celsius, durante a noite. No dia seguinte, transfira as amostras para uma placa redonda de fundo 96, e adicione os anticorpos conjugados de floresnce apropriados a cada poço. Após uma incubação de 1 hora a 4 a 10 graus Celsius, adicione 100 microliters de PBS a cada poço e abra o software de aquisição.
Selecione o programa de inicialização do cítmetro e do sistema, para iniciar o instrumento e abrir um novo experimento. Crie um modelo experimental e selecione a placa e adicione a placa. Selecione a posição das amostras na placa e clique no conjunto como amostra também.
Digite o nome da amostra nas regras de nomeação, abra a guia do canal e selecione os canais de sinal de floresnce apropriados. Agora coloque a placa no instrumento. E clique no gráfico de pontos, para criar uma nova área de dispersão para a frente versus o gráfico de pontos da área de dispersão lateral.
Selecione inicializar para iniciar o laser e os fluidos e clique em correr para iniciar a aquisição. Ajuste a escala para mostrar a população no meio do lote de dispersão dianteira versus lateral, e desenhe um portão de contas em torno de toda a população amostral para excluir os detritos. Clique em parar e pontilhar para criar uma altura de dispersão para a frente versus o gráfico de pontos da área de dispersão dianteira e portão da amostra na população de contas.
Desenhe um novo portão em torno da população maior e nomeie-o Singlets, e clique em plot de ponto para criar um sinal fluorescente versus área de dispersão lateral, por fluoróforo experimental usado. Portão do novo gráfico de pontos sobre os Singlets. Em seguida, selecione o número de eventos para gravar e selecione o registro para iniciar a aquisição experimental.
Ao final da análise, carregue os arquivos de aquisição no software de análise apropriado e abra um novo protocolo. Crie gráficos de pontos para cada arquivo como apenas demonstrado, e defina todo o eixo de dispersão em escala linear, e todo o eixo florescente para a escala de registro. Em seguida, mostre a média geométrica florescente nos canais de sinais relevantes, para calcular a mudança completa na intensidade média de florescência, nas diferentes preparações de vesícula extracelular.
Depois de testar diferentes condições para definir a menor quantidade total de vesículas extracelulares para alcançar a fase exponencial inicial de uma curva média de intensidade de floresnce, o número mínimo de partículas foi determinado como 1 vezes 10 a 8 partículas por coloração. A concentração ideal de anticorpos por 1 vezes 10 a 8 partículas para alcançar o sinal mais alto sem ligação de anticorpos não específicos, foi determinada como 10 microgramas por mililitro para anticorpos anti CD9_FITC e anticorpos anti CD63_PE e cinco microgramas por mililitro para o anticorpo CD81_PE. Para confirmar a adequação do método, para analisar vesículas extracelulares em forma de copo, e não detritos de membrana, as vesículas extracelulares foram sônicas, resultando em uma diminuição na intensidade média de florescência, após apenas 30 segundos de sonicação, sem florescência detectada após um minuto de interrupção mecânica.
A própria purificação de X de células progenitoras cardíacas, como demonstrado, produz vesículas extracelulares, expressando baixos níveis de CD9 e altos níveis de CD63 e CD81 de ambas as populações celulares. Além disso, enquanto os marcadores de superfície do próprio X são claramente identificáveis sem ultracentrifugação, este passo de enriquecimento aumenta muito a intensidade média de floresnce desses marcadores. Ao trabalhar com vesículas extracelulares, há mais pelotas de partículas nano descuidadas podem ser facilmente perdidas.
Portanto, é essencial seguir todos os passos como demonstrado no protocolo. Usar vesículas extracelulares como biomarcador é agora uma das pesquisas de campo mais emergentes. E em breve, pode ser traduzido para o diagnóstico clínico usado como uma ferramenta alternativa de triagem.
