Name: next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons
Uploaded: 2014-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons at JoVE.com

Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

1 16S rRNA gene amplicon Biblioteca Preparação pelo método de fusão <ol><li> Descongele os primers (Atacante, F343-Iona-MIDXX: 5&#39;-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 &#39;; reverter, R533-IonP1: 5&#39;-CCT CTC TAT GGG CAG GTG TCG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;; negrito: adaptadores específicos Ion Torrent, itálico: chave de seqüenciamento para calibrar a intensidade do sinal no início do seqüenciamento prazo; fonte normal: os iniciadores específicos do modelo, X ... X: 10 pb de código de barras, ver Tabela 1 para algumas sequências de código de barras), a mistura principal 2x HotStartTaq Plus e as amostras. Misture bem antes de usar, exceto para a mistura principal que deve ser misturado delicadamente. </li><li> Prepara-se uma mistura de PCR (20 reacções ul) com 0,5 uM de iniciador inverso, 0,4 mg / ml de Albumina de Soro Bovino (BSA) e mistura mestre 1x HotStartTaq Plus. Adicionar 18,5 mL da mistura principal para eada tubo de PCR. </li><li> Adicionar um iniciador directo (0,5 uL, a 20 mM) com um código de barras diferente para cada uma das amostras que serão sequenciadas conjuntamente. Adicionar 1 ml de amostra (1-10 ng / ul) para o tubo de PCR. </li><li> Colocar os tubos num aparelho de PCR e executar o seguinte programa: desnaturação inicial a 95 ° C durante 5 min; 25 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 45 seg; alongamento final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR podem ser mantidas a 4 ° CO / N ou congeladas até serem utilizadas. </li></ol> 2. Amplicon Purificação, Quantificação e Pooling <ol><li> Preparar um gel de agarose a 2% utilizando as maiores pentes disponível. Adicionam-se 5 ul de corante de carga de gel de 6x para a reacção e carga sobre o gel, que separa cada amostra por um poço vazio. Submeter o gel a 70 V durante 50 min. </li><li> Tire uma foto do gel e cortar as bandas (tamanho esperado em torno de 250 pb: 190 bp produto mais 63 adaptadores pb e códigos de barras), utilizando um bisturi limpo. </li><li&gt; Pesar as bandas excisadas e proceder à extracção e purificação em gel dos produtos de PCR (com, por exemplo, kit Qiaquick Gel Extraction). </li><li> Quantificação de cada produto de PCR com PicoGreen e fazer diluições para se obter uma solução de estoque a 5 x 10 moléculas de 9 / l (cerca de 1 ng / mL). Se algumas amostras mostram uma menor amplificação, ajustar as diluições de uma concentração mais baixa, mantendo em mente que a concentração mais baixa, apropriado para procedimentos subsequentes é de 1,57 x 10 7 moléculas / mL (26 pM). </li><li> Piscina de 10 uL de cada produto de PCR diluídos para obter uma piscina equimolar de amostras. Prepare uma piscina separada para cada uma corrida sequenciamento planejado. Os produtos de PCR reunidos pode ser mantido no congelador, até ser utilizado. </li></ol> 3. Emulsão PCR e seqüenciamento <ol><li> Realizar PCR emulsão: <ol><li> Dilui-se os produtos de PCR combinados para 26 pM num volume de 25 ul. Descongele reagentes de um kit de modelo Ion PGM. </li><li> Prepare a emulsão mix PCR (reagentes fornecidos no kit) em uma capa da PCR e adicionar os produtos de PCR em pool e as partículas esfera (fornecidas) no banco. Misturar bem e inserir-se a mistura em um cartucho de filtro de topo e cuidadosamente com emulsão de óleo (fornecida). </li><li> Lentamente reverter o cartucho de filtro e carga sobre o aparelho PCR emulsão automatizado (por exemplo, Ion One Touch 2 instrumento). Selecione o programa apropriado e iniciar o procedimento. </li></ol></li><li> Depois de a emulsão de PCR automatizado tenha completado, remover o sobrenadante a partir dos tubos de recolha e de recuperar as partículas da esfera na parte inferior dos tubos. Ressuspender as esferas em 100 ul de solução de lavagem (fornecido com o kit) e tomar uma aliquota 2,0 ul para quantificação biblioteca. </li><li> Realizar a quantificação biblioteca. <ol><li> Misturar 100 mL de tampão SSPE (NaCl 150 mM, NaPO4 10 mM, 1 mM de Na 2 EDTA) com 2 ul de adaptador B&#39;-Fam (5&#39;-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 &#39;) da sonda e 2 ul de adaptador A-Cy5 (5&#39;-Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;) da sonda. Adicionar 52 ul desta mistura para a aliquota 2,0 ul feita no passo 3.2 e adicionar 2 mL de solução de lavagem (a partir do kit de molde) para as restantes 52 ul como um branco para a quantificação. </li><li> Incubar a 95 ° C durante 2 min, em seguida a 37 ° C durante 2 min. Transferir as misturas em tubos de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 1,0 ml de tampão de TEX (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,01% de Triton X-100, pH 8,0), misturar e centrifugar a 15.500 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e deixar 20 ul em cada tubo. Repita este procedimento de lavagem duas vezes. </li><li> Adicionar 180 mL de tampão TEX, voltar a suspender as partículas peletizadas e transferir para tubos de 500 mL qubit. </li><li> Medida de fluorescência para FAM e Cy5 usando um aparelho Qubit e calcular a relação das esferas positivas de usar a calculadora disponível no site da Ion Comunidade. </li></ol></li><li> Enriquecer o restante das partículas de esfera para as esferas positivas (que contêm ADN amplificado), utilizando um sistema automatizado de enriquecimento (por exemplo, iões One Touch Sistema enriquecimento). <ol><li> Reagentes pipeta nas cavidades apropriadas do previsto tira de 8 poços: Poço 1: partículas esfera do passo 3.2; Bem 2: pré-lavado contas MyOne Streptavidin C1 (13 ul); Bem 3, 4 e 5: solução de lavagem (fornecido no kit de molde); Bem 6: vazio; Bem 7: derretem-off (NaOH 125 mM, 0,1% de Tween 20); Bem 8: vazio. </li><li> Instale uma ponta no braço de pipetagem e um tubo de 0,2 ml para coleta de amostras. Iniciar o instrumento. No final do enriquecimento, adicionar 10 ul de solução (fornecida) neutralização. Os grânulos enriquecidos podem ser mantidas a 4 ° C durante até 15 dias. </li></ol></li><li> Inicializar o instrumento seqüenciamento: <ol><li> Conecte-se ao instrumento de seqüenciamento e preparar um plano de seqüenciamento de execução, especificando os detalhes do sequenciamento de execução. </li><li> Install na solução de lavagem # 2 (fornecido com o kit de sequenciação Ion PGM), a solução de lavagem # 1 (350 ul de NaOH a 100 mM) e a solução tampão de pH automático (fornecido). </li><li> Inicie o procedimento de inicialização e, quando solicitado a adicionar dATP, dGTP dCTP e nucleotídeos dTTP (fornecido) em seus respectivos tubos de 50 ml. Parafuso os tubos na máquina de sequenciamento e continuar o processo de inicialização. Quando a inicialização estiver concluída, iniciar o procedimento de execução imediatamente. </li></ol></li><li> Preparar amostras para seqüenciamento e carregar o chip: <ol><li> Recolher as esferas enriquecidos a partir do passo 3.4, na parte inferior do tubo por centrifugação a 15.500 xg, durante 1,5 min. Retirar o sobrenadante deixando exactamente 3 ul. </li><li> Adicionar 3 mL de iniciador de sequenciação (fornecido no kit de sequenciamento), misture bem, pipetando para cima e para baixo para voltar a suspender as partículas. Incubar a 95 ° C durante 2 min, em seguida a 37 ° C durante 2 min. </li><li> Adicionar 1 ml de polimerase (fornecido), misture bem e incubComeram a TA durante 5 min. Continuar para carregar a mistura da enzima-esfera sobre o chip de sequenciamento dentro de 30 min. </li><li> Durante a incubação, coloque o chip de sequenciamento no sequenciador e executar uma verificação de qualidade dos cavacos. Remover o líquido a partir do chip através de centrifugação e colocar a amostra no chip por pipetando lentamente para baixo a mistura de enzima-esfera (7 mL) e evitar a introdução de bolhas no chip. </li><li> Centrifuga-se o chip de três vezes durante 1 minuto numa microcentrífuga. Altere a orientação do chip em cada centrifugação e misture pipetando para cima e para baixo entre cada execução. </li><li> Coloque o chip no aparelho e começar a correr. </li></ol></li></ol> Análise 4 Básica Dados de Sequência <ol><li> Conecte-se ao servidor de dados de sequenciamento e baixar o arquivo fastq. Crie um arquivo delimitado por tabulação &quot;oligos&quot; contendo o primer eo código de barras da informação (ver exemplo no quadro 1). Faça o download dos arquivos de referência GreenGenes do Motwebsite hur ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li> Lançamento Mothur e realizar análises: <ol><li> Converter o arquivo para um fastq fasta e um arquivo de qualidade usando o seguinte comando: fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li> Determinar a associação de grupo de cada seqüência e aparar as seqüências usando o seguinte comando: trim.seqs (fasta = test.fasta, oligos = barcode.txt, QFile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minlength = 150, keepforward = T) </li><li> As várias opções pode ser modificado de acordo com o rigor pretendido </li><li> Classifique as seqüências na taxonomia GreenGenes usando o seguinte comando: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, method = wang, grupo = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, taxonomia = gg_99_otus.tax, corte = 50) </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

<html> O método aqui apresentado é simples e barato, e deve permitir que muitos laboratórios para acessar o poder de seqüenciamento metagenômica. Embora varia de acordo com a plataforma de sequenciamento utilizado, uma vez que as bibliotecas são construídas é necessário muito pouco hands-on do tempo, com a maior parte do processo que está sendo automatizada. Para a plataforma de sequenciamento utilizado aqui (Ion Torrent PGM), o procedimento completo pode ser realizada dentro de dois dias de trabalho. No momento da escrita (Setembro de 2013), os custos de reagentes relacionados com o exemplo descrito acima foram como se segue: Amplificação por PCR de 36 amostras: $ 25, a purificação do gel e o DNA PicoGreen quantificação de 36 amostras: $ 125, emulsão de PCR para uma amostra amplicão agrupada : US $ 150 e reagentes de seqüenciamento: US $ 250, para um total de US $ 550 ou US $ 15 por amostra ou $ 0,0015 por leitura filtrada qualidade. Este preço não inclui contrato instrumento de serviço, depreciação instrumento, salário técnico e uso de espaço de laboratório. tenda &quot;&gt; Um dos passos mais importantes é o de reunir todos os produtos numa proporção equimolar, com a finalidade de recuperar o número similar de leituras para cada uma das amostras. PicoGreen quantificação foi utilizada aqui, mas outros métodos podem ser apropriados, embora menos exacto (por exemplo, quantificação de UV, à base de gel de quantificação). Mesmo fazendo a quantificação mais precisa e de agrupamento, existe alguma variabilidade do número de leituras por amostra, e, no ensaio típico descrito na Tabela 2, que varia de 4.380 a 32.750 lê, com uma média de 10,338 leituras. Se o processamento de grande número de amostras (mais de 40-50), única coluna de purificação em gel pode ser substituído por purificação em gel em placa ou purificação usando grânulos com um tamanho de corte rigorosas (por exemplo, grânulos AMPure) . Até o momento, a tecnologia de sequenciamento de próxima geração mais utilizado para o gene 16S rRNA é 454 A Ion Torrent tecnologia de sequenciamento utilizado neste protocolo é conceitualmente muito semelhantea 454, e ambas as tecnologias são propensos ao mesmo tipo de erros de sequenciação. Não surpreendentemente, foi demonstrado que a Ion Torrent sequenciamento resultou em resultados de sequenciamento muito semelhantes a 454 seqüenciamento 10. Recentemente, muitos pesquisadores têm explorado o uso da tecnologia Illumina para 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento 18,19. Em qualquer caso, seria fácil de adaptar o protocolo corrente para outros sequenciadores de bancada como o Ilumina MiSeq ou a 454 GS Júnior alterando as sequências de iniciadores de fusão para coincidir com os códigos de barras e placas necessárias para estas tecnologias de sequenciação, como no método descrito recentemente para o Ilumina MiSeq 19. Como alternativa, os pesquisadores poderiam seguir os passos 1 e 2 do protocolo detalhado aqui e envie os amplicons reunidos para um centro de sequenciamento onde a emulsão PCR e sequenciamento seria realizada. O gene 16S rRNA leituras foram aparadas e classificados utilizando Mothur, mas muitas outras análises podem ser realizadas emAmplicons do gene 16S rRNA. Por exemplo, beta diversidade pode ser avaliada pelo cálculo das distâncias Unifrac entre cada par de amostra, utilizando o procedimento descrito no <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. Índices de diversidade alfa e número de unidades taxonômicas operacionais de cada amostra pode ser calculada usando ferramentas dentro QIIME como AmpliconNoise 21 ou usando o procedimento descrito por Huse et al. 22 e disponível dentro Mothur. Os iniciadores utilizados aqui amplificado das regiões variáveis ​​3 e 4 a partir do gene de rRNA 16S, mas em muitas outras regiões pode ser alvejado. No presente estudo, os genes de rRNA 16S foram amplificados a partir de material vegetal e a escolha de iniciador foi feito para evitar a amplificação do gene de ARNr 16S cloroplasto 23,24. Há uma grande variedade de outros iniciadores disponíveis, que variam em termos do comprimento do produto, de potência e utilidade taxonómica 25,26. No entanto, em todos os casos 200-400 bp lê do gene 16S rRNA não pode ser classificado de forma confiável em nível de espécie, e as análises são limitados ao gênero e os níveis taxonômicos superiores. Outros genes poderia ser mais apropriado se a informação nível de espécie é necessária, assim como os cpn60 e rpoB genes 27,28. Gotas drásticas futuras no custo do sequenciamento e aumentos no poder de ferramentas de análise pode torná-lo viável para substituir seqüência do gene 16S rRNA por metagenômica espingarda, mas até então seqüência do gene 16S rRNA continua sendo o padrão ouro de microbiologia ambiental.

Sequenciação metagenômico é uma tecnologia poderosa, uma vez que tem como alvo a totalidade da informação genética contida numa amostra ambiental. Existem diferentes sabores de sequenciamento metagenômica, incluindo seqüenciamento shotgun, bibliotecas de grande inserção e amplicon seqüenciamento. Amplicon sequenciação oferece a vantagem de ser relativamente barato, rápido e capaz de produzir leituras de uma região genómica que pode ser geralmente alinhado. Além disso, o fluxo de trabalho para a análise dos dados de sequenciação do amplicon é principalmente padronizado. No entanto, uma vez que é baseada na PCR, que tem todos os preconceitos relacionados com a especificidade incompleta, uma cobertura incompleta e iniciador influencia 1,2, o que torna esta abordagem semi-quantitativa na melhor das hipóteses. Várias regiões do genoma podem ser direcionados para o seqüenciamento amplicon incluindo genes funcionais, mas as opções mais populares são o uso de genes marcadores, tais como o gene 16S rRNA para gerar um perfil da comunidade. Tradicionalmente, 16S rRNA gene amplicon Sequencing foi realizada utilizando técnicas intensivas de trabalho que incluiu a clonagem em E. coli, a colheita de colónias e de extracção do plasmídeo seguido por Sanger de sequenciação nos plasmídeos isolados, e, consequentemente, a maioria dos estudos analisadas menos de 100 clones por amostra. Sequenciamento de próxima geração trouxe dois grandes avanços: a paralelização massiva das reações de sequenciamento e, mais importante, a separação clonal de modelos sem a necessidade de inserir fragmentos de genes em um host. Isso simplificou enormemente o seqüenciamento de amplicons do gene 16S rRNA, que agora está de volta como uma característica de rotina de muitos estudos de microbiologia ambiental, resultando em um &quot;renascimento&quot; para 16rRNA amplicon gene seqüenciamento 3. Desde o advento da Roche 454 seqüenciamento em 2005 4, várias outras tecnologias de sequenciamento de próxima geração têm aparecido no mercado (por exemplo, Illumina, Sólido, PacBio). Mais recentemente, a introdução da sequência de bancadars trouxe para pequenos laboratórios a capacidade de sequenciamento, uma vez exclusivo para os grandes centros de sequenciamento. Cinco máquinas de bancada estão disponíveis atualmente: o 454 GS Junior, a Ion Torrent Pessoal Genome Machine (PGM) e Proton, ea Illumina MiSeq e NextSeq 500 Embora todos estes sequenciadores oferecem menos lê por corrida e menos bases por dólar do que a maioria full- sequenciadores escala, são mais flexíveis, rápidas, e seus baixos custos de aquisição e de execução torna-los acessíveis para pequenos laboratórios acadêmicos. Sequenciadores de bancada são particularmente adequados para o amplicon, genoma pequeno e de baixa complexidade metagenome seqüenciamento em estudos de microbiologia ambiental, porque este tipo de estudos geralmente não requer uma profundidade extrema de seqüenciamento. Por exemplo, é geralmente aceite que a seqüência do gene 16S rRNA estuda o número de leituras por amostra não é primordial, como ~ 1000 lê pode gerar os mesmos padrões como vários milhões de conjuntos de dados lê 5. Dito isto, bancada próxima generatio<html> n sequenciadores ainda geram grandes quantidades de dados de sequência, com rendimentos máximos de ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 EUR (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 EUR (Ion Torrent Proton), ~ 10 EUR (Illumina MiSeq) e ~ 100 EUR (Illumina Próxima Seq 500), que é mais do que suficiente para a maioria dos estudos de microbiologia ambiental. Sequenciamento de próxima geração de amplicons 16S rRNA usando seqüenciadores de bancada foi recentemente aplicado a uma grande variedade de ambientes. Por exemplo, o Ion Torrent PGM tem sido usada para a comunidade análises de rejeitos de minas de urânio que tinham particularmente elevado pH e baixa permeabilidade 6, de sistemas de recirculação de aquicultura 7, de contaminados com hidrocarbonetos solos árticos 8,9, de areias de petróleo de mineração sedimentos afetados e biofilmes do rio Athabasca 10,11, da rizosfera de salgueiros plantadas em solos contaminados 12, dos corpos humanos e animais 13-16 e de digestores anaeróbicos 17. jove_content &quot;&gt; Neste contribuição que detalhe a nossa abordagem para sequenciar fragmentos amplificados do gene 16S rRNA em casa usando uma bancada sequenciador de última geração (o Ion Torrent PGM). Após a extração do DNA, os genes 16S rRNA são amplificados utilizando-level domain primers bacterianos que contêm adaptadores de sequenciação e as sequências originais, específicos de amostragem (códigos de barras). Os produtos de amplificação foram purificados, quantificadas e reunidas numa relação equimolar. As amostras combinadas são então amplificado por clonagem em uma emulsão de PCR e sequenciado. sequências resultantes são analisados ​​utilizando ferramentas da bioinformática publicamente disponíveis ( por exemplo, Mothur).

<table><tbody><tr><td>Ion 314 Chip Kit v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482261</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td><td>Life Technologies</td><td>4482006</td><td></td></tr><tr><td>Ion PGM Template OT2 200 Kit</td><td>Life Technologies</td><td>4480974</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td><td>Qiagen</td><td>203646</td><td></td></tr><tr><td>Primers and probes</td><td>IDT</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BSA 20 mg/ml</td><td>Roche</td><td>10,711,454,001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr></tbody></table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

Uma das principais questões em ecologia microbiana é &quot;Quem está aí?&quot; Esta pergunta pode ser respondida usando várias ferramentas, mas um dos padrões de ouro de longa duração é a seqüência amplicons 16S ribossomal RNA de genes (rRNA) gerados pelo nível de domínio PCR As reacções de amplificação de ADN genómico. Tradicionalmente, esta foi realizada por clonagem e Sanger (eletroforese capilar) sequenciamento de fragmentos amplificados por PCR. O advento do sequenciamento de última geração tem tremendamente simplificada e aumento da profundidade de sequenciamento para o seqüenciamento do gene 16S rRNA. A introdução de seqüenciadores de bancada agora permite que pequenos laboratórios para realizar seu 16S rRNA seqüenciamento em casa em questão de dias. Aqui, uma abordagem para 16S rRNA amplicon gene seqüenciamento usando uma bancada sequenciador de última geração é detalhado. O ADN ambiental é primeiro amplificado através de PCR utilizando os iniciadores que contêm os adaptadores de sequenciação e os códigos de barras. Eles são, em seguida, acoplado a partículas esféricas através da emulsão de PCR. As partículas são loaded num chip descartável e o chip é inserido na máquina de sequenciação após o que a sequenciação é realizada. As sequências são obtidas em formato fastq, filtrada e os códigos de barras são usados ​​para estabelecer a adesão amostra da lê. O filtrado e, em seguida, lê binned são analisados ​​utilizando ferramentas disponíveis publicamente. Uma análise exemplo, onde as leituras foram classificadas com um algoritmo de descoberta taxonomia dentro do pacote de software Mothur é dado. O método descrito aqui é simples, barato e simples e deve ajudar laboratórios menores para tirar proveito da revolução genômica em curso.

Após purificação em gel, com 25 ciclos de amplificação por PCR, os produtos de amplificação são geralmente numa concentração de 0,2-10,0 ng em 50 ul de água. Isto pode variar amplamente, dependendo da concentração de DNA de partida, o tipo de amostra e o kit de purificação utilizado. Recomenda-se para manter o número de ciclos de PCR para o mais baixo possível para evitar a formação de quimeras e diminuir vieses amplificação, tendo em conta que todas as amostras devem ser amplificados utilizando o mesmo número de ciclos. Para minimizar o número de leituras e policlonal esferas vazias e maximizar o número de leituras, o rácio Qubit deve situar-se entre 0,1 e 0,3 e a fluorescência de FAM deve ser acima de 200 Usando um chip 314 de um Ion Torrent PGM, a produção média é de cerca 0,3-0,5 M de boa qualidade lê depois da filtragem dos resultados em Mothur. Tabela 2 apresenta a composição típica do número de leituras após cada passo do processo para uma corrida contendo 36 environ multiplexadoamostras mentais amplificado com primers visando região V3-4 dos 16S e analisados ​​utilizando Mothur. Em Mothur, o procedimento trim.seqs gerar um arquivo &quot;* .trim.fasta&quot; contendo as sequências que passaram os filtros de qualidade e um &quot;* .scrap.fasta&quot; que contém as seqüências que não passar pelos filtros de qualidade, juntamente com a razão para rejeição no cabeçalho de sequência. Quando fornecido com códigos de barras no arquivo &quot;oligos&quot;, este comando também irá gerar um arquivo &quot;* .Grupos&quot; que contém a associação de grupo de cada seqüência com base na seqüência de código de barras. O procedimento classify.seqs gera um &quot;.tax.summary&quot;, que pode ser aberto no Excel. Este arquivo contém o resumo da afiliação taxonômica (em linhas) para cada uma das amostras (em colunas). Este arquivo pode ser usado para análises estatísticas jusante e visualizar a composição da comunidade em vários níveis taxonômicos. O arquivo &quot;.taxonomy&quot; contém o taxonômico detalhadofiliação para cada sequência. A composição média comunidade ao nível filo / classe em todas as 36 amostras é mostrado na Figura 1. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Composição média comunitária em nível filo / aula em todas as amostras. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> para a frente </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr height = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> código de barras </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Sample10 </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Exemplo de arquivo &quot;oligos&quot; para uso em Mothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> # De leituras </td><td style="width:123px;"> % Do passo anterior </td><td style="width:107px;"> Médio. por amostra </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Número de poços </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Wells com miçangas </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88,20% </td><td align="center"> 30947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Contas com modelos </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99,90% </td><td align="center"> 30910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Contas monoclonais </td><td align="center"> 826805 </td><td align="center"> 74,30% </td><td align="center"> 22967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> Boa qualidade lê (saída do sequenciador) </td><td align="center"> 782204 </td><td align="center"> 94,60% </td><td align="center"> 21728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Passe Mothur filtros (min. Média. Índice de qualidade de 20 sobre uma janela 50pb, min. Comprimento de 150bp) </td><td align="center"> 372168 </td><td align="center"> 47,60% </td><td align="center"> 10338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificadas no nível de filo em GreenGenes (50% limite de confiança) </td><td align="center"> 342171 </td><td align="center"> 91.90% </td><td align="center"> 9505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificadas no nível de família em GreenGenes (50% limite de confiança) </td><td align="center"> 316512 </td><td align="center"> 92,50% </td><td align="center"> 8792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> Classificadas no nível de gênero em GreenGenes (50% limite de confiança) </td><td align="center"> 289899 </td><td align="center"> 91,60% </td><td align="center"> 8053 </td></tr></tbody></table> Tabela 2 Número de leituras produzido a partir de uma corrida típica de 36 amostras ambientais multiplexados em um Ion Torrent 314 chips.

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Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

83.3K visualizações.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

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Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Análise metagenômica de Silagem

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Genética

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of taxonomic and functional groups in environmental samples. Used in combination with a reverse transcriptase reaction (RT-q-PCR), it can also be employed to quantify gene transcripts. q-PCR makes use of highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction. Therefore, the biases associated with &#39;end-point&#39; PCR detected in the plateau phase of the PCR reaction are avoided. A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. First, a method for the co-extraction of DNA and RNA from coastal sediments, including the additional steps required for the preparation of DNA-free RNA, is outlined. Second, a step-by-step guide for the quantification of 16S rRNA genes and transcripts from the extracted nucleic acids via q-PCR and RT-q-PCR is outlined. This includes details for the construction of DNA and RNA standard curves. Key considerations for the use of RT-q-PCR assays in microbial ecology are included.

A protocol to quantify bacterial 16S rRNA genes and transcripts from coastal sediments via real-time PCR is provided. The methodology includes the co-extraction of DNA and RNA; preparation of DNA-free RNA; and 16S rRNA gene and transcript quantification via RT-q-PCR, including standard curve construction.

DNA-RNA simultânea de extração de sedimentos costeiros e quantificação de 16S rRNA genes e transcritos por PCR em tempo real

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Ambiente

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq em Bactérias: um Protocolo de Coleta de Amostras e Preparação de Bibliotecas para Sequenciamento NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Bioquímica

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificação de patógenos bacterianos raras, seqüência do gene 16rRNA e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Imunologia e Infecção

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pirosequenciamento de Identificação Microbiana e Caracterização

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Biologia

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...