Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão 1SC2GM092789-01A1, e MS era um estudioso de pesquisa de NMSU Médico Howard Hughes Instituição Programas de Pesquisa de Graduação. O vídeo foi dirigido e produzido por Amy Lanasa e coordenado pelo Dr. Philip Lewis com o Creative Media Institute NMSU.

Procedimento 1. Elevando o mosquito <ol><li> Rear mosquito Anopheles gambiae estirpe G3 em insetário de 27,5 ° C com uma humidade de 80% e no ciclo de 12:12 horas luz / escuridão. </li><li> Alimentar as larvas com alimentos chão gato com levedura de cerveja na proporção de 1:1. </li><li> Alimentar os mosquitos adultos em sangue de camundongos no dia 3 pós-emergência para a produção de ovos. </li></ol> 2. Dissecção Gut mosquito <ol><li> Autoclave instrumentos de dissecação (slides e fórceps). </li><li> Colete 50 mosquitos usando um aspirador e colocá-los em CO cama fluxo 2 (Ultimate Flypad). Enxaguar um espécime mosquito sequencialmente em três placas de Petri contendo 70% de etanol para limpar a superfície do corpo do mosquito. </li><li> Coloque a amostra sobre uma lâmina de vidro sob uma lupa estereoscópica. Remover o intestino. </li><li> Colete 50 coragem por condição de isolamento de DNA metagenômico. Colete 50 coragem por condição de isolamento do RNA metagenomico. </li></ol&gt; 3. Isolamento de DNA metagenomico Nota: DNA metagenômico é isolado utilizando o Meta-G-Nome DNA Isolation Kit (Epicentre Biotechnologies), com a modificação descrita abaixo. <ol><li> Coloque 50 entranhas de mosquito em 300 TE ul. Homogeneizar durante 1 min, utilizando Bio-Gen PRO200 homogeneizador (PRO Scientific Inc, EUA) a 2000 rpm de velocidade sobre o gelo. </li><li> Adicionam-se 2 jil de Ready-Lyse solução de lisozima e 1 ul de ARNase A à suspensão de células. Mistura por agitação em vórtex e incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar 300 ul de Meta-Lysis Solution (2X) e 1 ml de Proteinase K para o tubo. Misture por vórtex. Resumidamente pulso-centrifugar o tubo para assegurar que a totalidade da solução está no fundo do tubo, e incubar a 65 ° C durante 15 minutos, arrefecer até à temperatura ambiente, e depois colocar em gelo durante 3-5 min. </li><li> Adicionar 350 ul de reagente de precipitação de proteínas MPC para o tubo e misturar vigorosamente em vortex durante 10 seg. </li><li> Pellet tele detritos por centrifugação durante 10 min a 12000 xg a 4 ° C. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo limpo de 2 ml, e rejeitar o sedimento. </li><li> Adicionar 570 uL de isopropanol ao sobrenadante. Misture por vezes invertendo o tubo várias. </li><li> Pellet o DNA por centrifugação durante 10 min a 12000 xg a 4 ° C. Remover o isopropanol sem desalojar o sedimento de DNA. </li><li> Adicionar 500 ul de etanol a 75% para lavar o sedimento. Centrifugar durante 5 minutos a 12000 xg a 4 ° C. Remover o etanol, sem perturbar o sedimento de DNA. Ar-secar o sedimento à temperatura ambiente durante 2 min. Nota: Não excesso de seca, o pellet de DNA. </li><li> Ressuspender o sedimento de ADN em 50 ul de tampão TE. </li><li> Validar o tamanho do DNA isolado em comparação com o ADN de controlo Fosmid (40 kb, 100 ng / ul) fornecido no kit, através de electroforese em gel num gel de agarose a 1%. </li></ol> 4. Isolamento de RNA total Nota: Limpe a área de trabalhocom RNaseZap para minimizar a contaminação com RNase. RNA metagenoma foi isolado a partir de amostras intestinais de mosquitos usando o Reagente de Isolamento TriPure (Roche) com uma pequena modificação. <ol><li> Coloque 50 entranhas de mosquito em um tubo de 2 ml de reagente com 500 ul TriPure isolamento. Homogeneizar durante 1 min a 2000 rpm de velocidade em gelo usando um homogeneizador. Deixe sentar à temperatura ambiente durante 5 min para permitir que a dissociação de complexos nucleoproteicos. </li><li> Adicionam-se 100 ul de clorofórmio e agitar em vortex por 12 segundos, e deixe sentar à temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Centrifugar a 10.000 xg durante 10 min. Retire cuidadosamente o tubo sem perturbar fases separadas. </li><li> Transferir fase aquosa para um novo tubo, adicionar 250 uL de isopropanol, misturar bem e colocou-se a -20 ° C durante 20 min. </li><li> Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C para precipitar o RNA. </li><li> Desprezar o sobrenadante sem desalojar pelota. Lavar o sedimento com 750 ul de etanol a 75%. </li><li> Pipetar fora o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ari secar o tubo durante 2 min. </li><li> Ressuspender o RNA com 30 ul de água livre de nuclease. </li><li> Tratar o ARN total com ADNase a 37 ° C durante 20 min e, em seguida, desactivar a DNase por incubação a 75 ° C durante 15 min. RNA precipitado com etanol e RNA ressuspender em 30 ul de água livre de nuclease. </li><li> Determinar a quantidade de ARN total utilizando um NanoDrop. </li></ol> 5. Esgotamento RNA ribossomal Nota: O protocolo foi desenvolvido com base em métodos descritos anteriormente 12,13,15. <ol><li> A amplificação por PCR de fragmentos de genes de RNA ribossômico Este passo cria pools de amostras específicas do rRNA, que serão utilizadas como moldes para a transcrição in vitro para a produção de anti-sentido de RNA ribossomal (arRNA) sondas que são complementares ao rRNA na amostra de RNA total. <ol><li> Projetar e sintetizar conjuntos de primers para rRNA fragmento de PCR (Tabela 1). </li><li> Executar PCR em 50reacção ul usando DNA-polimerase Taq (Qiagen) com 50 ng de ADN molde, 1 x tampão de PCR, 1,5 mM Mg 2 Cl, 0,2 uM primários com 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 10 seg, 15 seg de recozimento a 40 ° C para amplicon 23S bacteriano, e 50 ° C para os amplicons outros, e que se estendem a 72 ° C durante 1 min (extensão final a 72 ° C durante 5 min). </li><li> Ver os produtos de PCR em gel de agarose a 1%. </li><li> Purifica-se os produtos de PCR utilizando o kit de purificação PCR QIAquick com eluição em 50 ul de tampão de eluição. Quantificar a concentração usando NanoDrop. </li></ol></li><li> Transcrição in vitro de sondas marcadas com biotina-anti-sentido de rRNA (arRNA). Nota: Neste passo, as sondas específicas de amostras de vários amplicons de rRNA são sintetizados utilizando o kit MEGAscript T7. <ol><li> Defina-se uma reacção de 20 uL de cada amostra de rRNA amplicon específico misturando os ingredientes a seguir (Tabela 2). Incubar durante a noite a 37 ° C. <strong&gt; Nota: normalmente os rendimentos de reação&gt; 50 ug de RNA. </li><li> Adicionar 1 ml de DNase I (incluso no kit) à reacção e incuba-se a 37 ° C durante 20 min para remover o molde de DNA. </li><li> Adicionam-se 100 ul de etanol a 100% para a reacção, de centrifugação a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C para precipitar sintetizado arRNA. Elimine o sobrenadante e lavar o sedimento com 750 ul de etanol a 75%. Ressuspender sondas de RNA em 50 ul de água livre de nuclease. </li><li> Quantificar RNA usando uma concentração NanoDrop. Sondas de armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> rRNA subtração com arRNA biotinilado. Nota: Este passo utiliza o arRNA biotinilado para hibridar com rRNA na amostra de RNA total. Os híbridos rRNA-arRNA são capturados por estreptavidina-pérolas magnéticas revestidas. O procedimento baseia-se no protocolo descrito na referência 13, com pequenas modificações. <ol><li> Reagentes <ol><li> Prepare NaOH 0,1 N, 20X cloro sódioide-citrato (SSC) e 1 X SSC com formamida a 20%. </li></ol></li><li> Hibridização <ol><li> Misturar 1 ug de RNA total com 16S e 23S sondas (0,75 ug de cada), e sondas de mosquito 18S 28S (0,75 ug de cada), 1 ul de inibidor de RNase, 2,5 ul de tampão 20X SSC, 10 ul de formamida a 100% em um tubo de PCR 200 ul , adicione a água livre de nuclease a 50 ul. </li><li> Colocar o tubo de reacção num termociclador e incubar a 70 ° C durante 5 minutos, para abrir a estrutura secundária e rampa para baixo a 25 ° C, utilizando incrementos de 5 ° C durante 1 min cada ° C para permitir a hibridação das sondas de rRNA e arRNA. </li></ol></li><li> Remoção de rRNA <ol><li> Transferir 300 uL de estreptavidina pérolas revestidas dentro de um tubo ml 1.7. Colocar o tubo em uma cremalheira de separação magnética para imobilizar as contas. Remover o sobrenadante. Voltar a suspender as pérolas em 300 ul de NaOH 0,1 N e mix bem. Colocar o tubo de volta para a cremalheira magnético e pipetar fora o sobrenadante. Voltar a suspender as pérolas em 300 ul de SSC 1X, misturar bem, imobilizar as contas e pipetar fora o sobrenadante. Repetir a lavagem com 300 ul de 1X SSC mais uma vez. </li><li> Fazer 3 aliquotas de grânulos, 100 ul de cada, em 1,7 ml tubos. Colocar o tubo no suporte magnético, e remover o sobrenadante por pipetagem. Nota: As alíquotas de contas são utilizadas para a captura de três rodadas de biotinilados rRNA-arRNA híbridos. </li><li> Adicionar 50 ul de SSC 1X, com formamida a 20% da reacção de hibridação em 50 ul. Transferir a mistura reaccional para o tubo de primeira alíquota do grânulo, e misturar bem. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min para permitir que os biotinilados sonda de rRNA-híbridos para ser capturado por esferas de estreptavidina. Flick o tubo a cada 2 minutos para misturar, durante a incubação. </li><li> Colocar o tubo no suporte magnético para imobilizar as contas, transferir o sobrenadante para o segundo aliquot dos grânulos, misturar bem e incubar como acima. Realizar a captura terceira transferindo sobrenadante para o terceiro tubo de esferas. Misturar e incubar. </li><li> Transferência não-rRNA sobrenadante para um novo tubo e a purificação utilizando o kit MinElute conduta RNeasy para remover formamida seguindo o manual do fabricante. </li><li> Verificar a eficiência depleção rRNA usando um Agilent 6000 kit RNA chip de Pico em um Bioanalyzer (Figura 4). </li></ol></li></ol></li></ol> Nota: As amostras de rRNA depleção de RNA são sujeitos a amplificação de mRNA se necessário 8.

<ol>
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M., Terenius, O., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=16S+rRNA+gene-based+identification+of+midgut+bacteria+from+field-caught+Anopheles+gambiae+sensu+lato+and+A.+funestus+mosquitoes+reveals+new+species+related+to+known+insect+symbionts.">16S rRNA gene-based identification of midgut bacteria from field-caught Anopheles gambiae sensu lato and A. funestus mosquitoes reveals new species related to known insect symbionts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 7217-7223 (2005).</li><li>Simon, C., Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analyses:+past+and+future+trends.">Metagenomic analyses: past and future trends.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 1153-1161 (2011).</li><li>Wang, Y., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+fragments+in+bacterial+16S+rRNA+genes+and+primer+design+for+16S+ribosomal+DNA+amplicons+in+metagenomic+studies.">Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies.</a> PLoS One. 4, e7401 (2009).</li><li>Hunt, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+23S+rRNA+PCR+primers+for+use+in+phylogenetic+studies+of+bacterial+diversity.">Evaluation of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of bacterial diversity.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2221-2225 (2006).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

A comunidade microbiana complexa reside no ecossistema estômago do mosquito 14,16,17. Metatranscriptomic seqüenciamento (RNA-seq) pode revelar informações dependente do contexto funcional interrogando o microbiana todo transcriptoma 4,18. Tecnicamente, oligo-d enriquecimento (T) de mRNA mediada procariótico não é aplicável devido à ausência de poli estáveis ​​(A) tails dos mensageiros. Alternativamente, a depleção de rRNA foi usado para o enriquecimento de mRNA. Aqui, foi desenvolv...

Próxima geração de tecnologia de seqüenciamento tem muito avançado estudo metagenômica, permitindo avaliar a composição taxonômica e funcionalidade genética de um conjunto microbiana. RNA-Sequencing (RNA-Seq) 1 pode ignorar os métodos baseados em cultura para investigar metatranscriptomes microbianas em 2-5 contextos diferentes. Um dos principais obstáculos à microbiana RNA-seq é a dificuldade no enriquecimento do mRNA, como as espécies de ARNm procariótico não são estavelmente polyadenylated. Portanto, oligo d (T) enriquecimento mensageiro mediada não é aplicável. Remoção de rRNA abundante é uma abordagem alternativa para o enriquecimento de mRNA. Kits comerciais de depleção de rRNA, tais como kit Enriquecimento bacteriana mRNA Microexpress (Ambion), RiboMinus Isolation Kit Transcriptoma (bactérias) (Life Technologies), e-mRNA Isolation kit APENAS Prokaryotic mRNA (Epicentre) que preferencialmente degrada rRNA com uma exonuclease, têm sido usados para a remoção de rRNA 6-8. No entanto, as sondas de captura em Microexpressou RiboMinus são bons para a remoção de rRNA a partir de conhecido típicos bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (ver as especificações dos fabricantes), mas menos compatível com o rRNA de micróbios desconhecidos. Por conseguinte, a remoção pode ser menos eficiente para 8-10 metagenoma amostras. Além disso, a fidelidade abundância de ARNm era questionável, quando o tratamento com exonuclease foi aplicado 11. No geral, subtração baseada esgotamento rRNA foi menos tendencioso e mais eficaz no enriquecimento de mRNA em ambientes metagenômico 10-13. O intestino do mosquito acomoda uma comunidade microbiana dinâmica 14. Estamos interessados ​​em caracterizar a função do intestino microbiome mosquito usando RNA-Seq. Numa amostra de RNA isolado a partir dos intestinos de mosquitos, ambos os ARN de mosquito e microbianos estão presentes. Aqui, descrevemos um protocolo modificado para usar sondas específicas da comunidade rRNA de forma eficiente esgotar rRNA mosquito e microbiana por hibridização subtrativa. O mRNA resultanteamostras enriquecidas são apropriados para RNA-Seq. O fluxo de trabalho geral é mostrada na Figura 1.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Meta-G-Nome 				DNA isolation kit</td>
 <td>Epicentre</td>
 <td>MGN0910</td>
 <td>Metagenomic 				DNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TriPure </td>
 <td>Roche</td>
 <td>11667165001</td>
 <td>Mdetagenomic 				RNA isolation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEGAscript 				T7 kit</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1334</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA probes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNaseZap</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9780</td>
 <td>RNase 				free working area </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-16-UTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11388908910</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-11-CTP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>4739205001</td>
 <td>In 				vitro synthesis of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin 				magnetic beads</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1420S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnetic 				separation rack</td>
 <td>NEB</td>
 <td>S1506S</td>
 <td>Capture 				of rRNA hybrids</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy 				mini kit</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>74104</td>
 <td>Purification 				of subtracted RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free 				DNase Set</td>
 <td>QIAGEN</td>
 <td>79254</td>
 <td>Removal 				DNA contamination </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agilent 				RNA 6000 Pico Kit</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Gen 				PRO200 				Homogenizer</td>
 <td>PRO 				Scientific</td>
 <td>01-01200</td>
 <td>Mosquito 				gut tissue homogenization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NanoDrop 				1000 Spectrophotometer</td>
 <td>Thermo 				Scientific</td>
 <td></td>
 <td>DNA 				&amp; RNA quantitation</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2100 				Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent 				Technologies Inc.</td>
 <td>G2940CA</td>
 <td>Electropherogram 				of RNA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

depletion of ribosomal rna for mosquito gut metagenomic rna-seq

O intestino do mosquito acomoda comunidades microbianas dinâmicas em diferentes estágios do ciclo de vida do inseto. Caracterização da capacidade genética e funcionalidade da comunidade intestino irá fornecer informações sobre os efeitos da microbiota intestinal em traços de vida do mosquito. Metagenomico RNA-Seq tornou-se uma importante ferramenta para analisar transcriptomas de micróbios vários presentes em uma comunidade microbiana. RNA mensageiro compreende geralmente apenas 1-3% de ARN total, enquanto rRNA constitui cerca de 90%. É um desafio para o enriquecimento de RNA mensageiro a partir de uma amostra de metagenômico microbiana RNA pois a maioria das espécies de ARNm procariótico falta estáveis ​​poli (A) tails. Isto evita que o oligo d (T) de isolamento de mRNA mediada. Aqui, nós descrevemos um protocolo que emprega amostra derivada de rRNA capturar sondas para remover rRNA a partir de uma amostra de RNA metagenômico total. Para começar, os dois fragmentos de mosquito e microbianas rRNA pequenas e grandes subunidades são amplificados a partir de uma amostra de DNA metagenômico comunidade. Então, a comunicaçãonitárias específicas biotinilados anti-sentido de sondas de RNA ribossomal são sintetizados in vitro usando T7 ARN-polimerase. As sondas biotiniladas rRNA são hibridizadas para o RNA total. Os híbridos são capturados por esferas revestidas com estreptavidina e removido a partir do ARN total. Este protocolo de subtração baseada remove eficientemente tanto mosquito e rRNA microbiano a partir da amostra de RNA total. O mRNA da amostra enriquecida é adicionalmente processado para o ARN e amplificação de RNA-Seq.

O protocolo inclui três secções: (1) a preparação de moldes de ADN para metagenoma rRNA PCR, (2) a criação de sondas de amostra de rRNA de captura específicos, (3) a depleção de rRNA a partir de ARN total por hibridação subtractiva. Isolamento de alta qualidade metagenômico ADN e ARN são essenciais para o processo. A modificação Meta-G-Nome protocolo de isolamento de ADN de alta qualidade produz DNA metagenômico de vísceras de mosquitos, conforme mostrado na Figura 2. Ele pode ser um d...

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Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

A ribosomal RNA protocolo de depleção (rRNA) foi desenvolvido para enriquecer o RNA mensageiro (mRNA) de RNA-seq do intestino metatranscriptome mosquito. Sondas de amostras específicas rRNA, que foram usados ​​para remover rRNA via subtração, foram criados a partir do mosquito e seus micróbios intestinais. Desempenho do protocolo pode resultar na remoção de aproximadamente 90-99% do rRNA.

Esgotamento de RNA ribossômico para metagenomico Gut Mosquito RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

depletion-of-ribosomal-rna-for-mosquito-gut-metagenomic-rna-seq

Research

JoVE Journal

Biology

19.5K visualizações.  New Mexico State University. A ribosomal RNA protocolo de depleção (rRNA) foi desenvolvido para enriquecer o RNA mensageiro (mRNA) de RNA-seq do intestino metatranscriptome mosquito. Sondas de amostras específicas rRNA, que foram usados ​​para remover rRNA via subtração, foram criados a partir do mosquito e seus micróbios intestinais. Desempenho do protocolo pode resultar na remoção de aproximadamente 90-99% do rRNA.