Nosso protocolo apresenta uma ferramenta otimizada para estudar o coração de zebrafish in vivo e descreve a incorporação de técnicas de imobilização, juntamente com o pipeline de aquisição e análise de dados para imagem cardíaca. Zebrafish é um sistema modelo cardíaco com um grande potencial para aplicações como tela de drogas. Protocolo que permite imagens suaves em condições fisiológicas são cruciais ao estudar doenças cardíacas.
O fluxo de trabalho aqui apresentado se concentra na imagem do coração embrionário de zebrafish, mas uma versão modificada pode ser aplicada a várias outras amostras e experimentos, incluindo lula, verme e hidra. Comece pela coleta dos embriões obtidos a partir da reprodução das linhas transgênicas desejadas. Mantenha os embriões a 28 graus Celsius em uma placa de Petri cheia de meio de peixe E3.
Use uma agulha de vidro de furo montada em um micromanipulador e conectada a um injetor de pico para injetar 30 picogramas de alfa-bungarotoxin mRNA na gema de um ou dois embriões de estágio celular para imobilizar o peixe. Mantenha os ovos a 28 graus Celsius em uma placa de Petri cheia de meio E3, e transfira os ovos a cada 24 horas para um novo prato contendo meio E3 fresco até a imagem. Para evitar a formação de pigmentos, se o fundo do zebrafish não for albino, transfira peixes às 25 horas após a fertilização para um novo prato contendo meio E3 com inibidor de tyrosinase de 0,2 milimole 1-fenil 2-thiourea, também conhecido como PTU.
Para endireitar o tubo de propileno fluorado de etileno coloque o tubo em uma tubulação segura de vidro ou aço autoclave com o diâmetro interno correto para caber os tubos de polímero e autoclave a 180 graus Celsius por duas horas. Uma vez que os tubos atinjam a temperatura ambiente, remova o tubo de polímero endireitado. Para limpar o tubo, use uma seringa de 50 milímetros para lavar o tubo duas vezes com um molar de hidróxido de sódio.
Corte o tubo do tamanho de um tubo de centrífuga de 50 mililitros, coloque em um tubo de centrífuga cheio de 0,5 molar de hidróxido de sódio e ultrassônico por 10 minutos. Lave o tubo de propileno fluoretado de etileno com água dupla destilada, seguido de 70% de etanol. Tubos de transferência um tubo de centrífuga fresco continha 70% de etanol e ultrassônico por 10 minutos.
Após a ultrassonação, lave o tubo pela última vez com água dupla destilada e guarde-o em um tubo de centrífuga contendo água dupla destilada. Depois de dissolver o ponto de fusão baixo agarose em E3 médio despeje a agarose derretida em uma placa de vidro ou petri plástico para fazer um casaco de um a dois milímetros. Uma vez que a agarose esteja solidificada, despeje suavemente o meio E3 em cima do ágar para evitar a secagem.
Sele a placa com filme de parafina e armazene a quatro graus Celsius. Descongele a solução de estoque de tricaine e adicione 0,02% de tricaine ao meio E3 sem azul metil para usar como meio de incorporação. Use uma pipeta de vidro descartável para transferir peixes para o meio de incorporação.
Verifique se o peixe parou de se mover e o coração está batendo em uma velocidade semelhante em comparação com o controle. Corte o tubo de propileno de etileno fluorado para o comprimento ideal com uma lâmina de barbear. Prepare uma seringa com uma cânula de extremidade sem cortes.
Encha a seringa com ar, depois coloque o tubo na agulha e limpe qualquer água restante esvaziando a seringa. Em seguida, encha o tubo de propileno fluorado de etileno montado em uma seringa com mídia. Insira um embrião no tubo, mantendo a cabeça do peixe perto da extremidade do tubo, evitando a formação de bolhas.
Usando uma lâmina de barbear, corte cuidadosamente o tubo na borda da cânula da extremidade cega, ou agulha. Depois de descartar qualquer líquido na parte superior do prato revestido de ágar, mergulhe o tubo diretamente no ágar. Gire o tubo e retire-o para soltar o plugue da cama agarose.
Verifique a presença do plugue de ágar na extremidade do tubo. Para imagens de longo prazo, corte de três a cinco orifícios no tubo em cada direção cardeal, pelo menos cinco milímetros acima da extremidade do peixe, colocando uma lâmina de barbear perpendicular ao eixo do tubo e faça uma incisão no tubo a 30 graus até chegar à mídia de montagem. Em seguida, faça uma segunda incisão a 180 graus para criar um orifício e enrolar o tubo para visualizar os cortes claramente.
Transfira o embrião montado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo mídia de incorporação até estar pronto para a imagem. Monte o tubo no suporte da amostra e encha a câmara de imagem com mídia de incorporação. Coloque o titular da amostra no palco com a amostra mergulhando na câmara.
Verifique a saúde dos peixes embutidos avaliando visualmente a frequência cardíaca, e se a batida cardíaca é muito lenta descarte a amostra. Use sempre a mesma posição amostral para imagens reprodutíveis e gire o peixe para que ambos os olhos estejam no plano focal. Em seguida, gire o peixe aproximadamente 20 a 30 graus no sentido anti-horário por 48 horas após a imagem de fertilização.
Quando o peixe se adaptar à potência laser, selecione o lado de iluminação que dá a melhor qualidade de imagem. Em cada plano Z, grave de quatro a cinco batimentos cardíacos a 300 quadros por segundo, ou mais. Para registrar o coração batendo mova a amostra passo a passo através da folha de luz e use um espaçamento Z de um a dois micrômetros para cobrir toda a profundidade do coração.
Carregue o arquivo 4D em um software de renderização 3D para explorar os dados e gerar filmes do coração de zebrafish renderizado. Às 48 horas após a fertilização, o coração acaba de passar por looping e tem duas câmaras, o ventrículo e o átrio, mas ainda não desenvolveu as válvulas. As diferentes estruturas cardíacas, como ventrículo, canal atrioventricular, átrio, trato de entrada e trato de saída são facilmente distinguíveis.
Os dados indicaram batimentos precisos e revelaram interações complexas entre as duas camadas celulares do coração, o miocárdio, uma única camada muscular celular contraindo e gerando força, e o endocárdio, uma única camada celular conectando o coração à vasculatura. O mais importante é sempre verificar a saúde da amostra e batimentos cardíacos consistentes sob um estereoscópio. Embora as técnicas convencionais muitas vezes afetem a forma ou função do coração, nossos métodos nos fornecem dados dinâmicos e não perturbados do coração pulsante que nos ajuda a entender o essencial do coração embrionário primitivo.
