Gostaríamos de agradecer a Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli e Basile Gurchenkov ajuda a projetar e fazer o molde descrito neste protocolo. Este trabalho foi apoiado pela FRM (DEQ20140329553), o ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), a EMBO Young Investigator programa da Comunidade Europeia, a ERC CoG N ° 682938 Evalve e pela subvenção ANR-10-LABX-0030-INRT, um fundo de Estado francês gerenciado pelo a Agence Nationale de la Recherche sob o quadro programa Investissements d'Avenir rotulado ANR-10-IDEX-0002-02.

1. preparar moldes e montagem do agarose
<ol><li>Crie um molde com as dimensões indicadas na Figura 1 , usando uma impressora 3D ou ferramentas de oficina mecânica tradicional.</li>
	<li>Pipete cerca de 1,5 mL de agarose a 1% derretido em um prato de plástico montagem 35mm. Coloque o molde de plástico o agarose líquido, tendo o cuidado de evitar armadilhas de ar entre o molde e o agarose. Coloque o prato em 4 ° C, espere até a agarose endurece (leva cerca de 5 min) e, em seguida, remover o molde plástico.</li>
	<li>Para armazenar o prato de montagem para uso posterior, cubra o prato com a sua tampa, em seguida, enrole tanto o prato e a tampa firmemente com parafilme. O prato de montagem pode ser armazenado lado tampa virada para baixo, para até 5 dias a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare com antecedência alíquotas de 1 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 0,7% em 1,5 mL a tubos de Eppendorf para usar no dia da montagem. Nota: Os poços de agarose do prato montagem deformarão ao longo do tempo como a água evapora se parafilm não é enrolado os pratos firmemente.</li>
</ol>2. obtenção de embriões para o Photoconversion
<ol><li>Incross o Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) linha e crescer aproximadamente 200 embriões em meio de embrião no escuro a 28,5 ° C. Para obter mais detalhes sobre como cruzar linhas de zebrafish, refira por favor o JoVE ciência educação de banco de dados11.</li>
	<li>Depois de 5h, mas antes de 24 h, tratar os embriões com 1-fenil-2-tioureia (PTU) para evitar a formação de pigmento (0,003% PTU no meio do embrião).</li>
	<li>Cerca de 1h antes do início da photoconversion, embriões de tela sob um estereoscópio fluorescente e selecionados 5 embriões saudáveis que aparecem para expressar a fluorescência verde brilhante. O uso da luz de baixa intensidade ao Visualizar embriões é recomendado para evitar a exposição dos embriões a luz ambiente para evitar photoconverting Kaede em células não-específica.</li>
</ol>3. incorporação
<ol><li>Prepare-se 10 mL de mídia de montagem: 0,02% tricaina e 50mm BDM no meio do embrião.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de meio de montagem para o prato de montagem e permitir a 15-30 min para a solução de agarose se espalham.</li>
	<li>Entretanto, derreta uma alíquota de 1 mL de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) 0,7%, colocando o tubo em um bloco de calor de 70 ° C por cerca de 5 min.<ol>
<li>Esperar o LMP agarose esfriar um pouco e, em seguida, adicione 25 µ l de solução de metanosulfonato de 8 mg/mL e 40 µ l de solução 1M de BDM ao tubo de agarose de baixo ponto de fusão. Mix pipetando para cima e para baixo, então transfira o tubo para um bloco de calor de 38 ° C para manter o agarose LMP em estado líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em uma Petri prato com meio de embrião, cuidadosamente dechorionate os embriões pré-selecionados sob o microscópio estereoscópico usando fórceps, tomando cuidado para não danificar os embriões.</li>
	<li>Transferi os embriões para um prato separado contendo 2 mL de mídia de montagem.<ol>
<li>Quando os corações dos embriões são interrompidos (leva cerca de 5-10 min), transferência de embriões para a montagem do prato e organizar embriões em poços usando fórceps para que eles mentem em um ângulo de 25 graus, coroa apontando em direção à parte mais profunda do poço, gema voltada para cima.</li>
		<li>Quando os embriões são mais ou menos no lugar, remova a mídia, incorporar os embriões em ~ 200 µ l de 0,7% LMP agarose contendo tricaina e BDM e reajustar as posições dos embriões, inclinando os embriões à esquerda ou à direita conforme necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esperar até os conjuntos de agarose LMP (leva cerca de 5 min) e, em seguida, adicionar o meio de montagem para o prato. Os embriões estão agora prontos para ser photoconverted. Nota: A tricaina e o BDM são usados para anestesiar os embriões e parar o coração dos embriões, respectivamente. Meios de montagem podem ser preparados no dia anterior de imagem, mas certifique-se de proteger os meios de comunicação de luz. Nota: O posicionamento correto dos embriões é importante para permitir um caminho claro do laser para as células que deseja photoconvert. Posicione a cabeça do embrião perto do início do poço para que a luz do laser não tem de viajar para longe para alcançar o embrião, e para que os embriões podem ser facilmente desmontados depois de photoconversion.</li>
</ol>4. Photoconversion
<ol><li>Em um microscópio confocal na posição vertical (como Leica SP8) equipado com um 405 nm, 488 nm e fonte de laser 561 nm, localizar o embrião do coração usando transmitidos luz branca (brightfield) e uma lente objetiva (como Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objectivo). Verifique se há fluorescência vermelha de Kaede usando o laser nm 561 (ou seja, laser DPSS 561, na intensidade de ~ 5%, detector fixado em 728-589 nm). Em seguida, visualize o endocárdio usando laser 488 nm (ou seja, 30 mW várias linhas laser de argônio na intensidade de ~ 5%, detector fixado em 502-556 nm).</li>
	<li>Entra no modo de "FRAP" sobre o software de aquisição de microscópio. Selecione ~ 1% da potência do laser para ambos 488 nm e 561 nm de lasers.</li>
	<li>Concentre-se no avião de interesse, selecione uma região de interesse (ROI), em seguida, photoconvert células usando a 405 nm diodo do laser com potência de 25% do laser, varredura sobre o ROI três vezes. Kaede insuficiente deveria photoconverted no ROI, digitalizar a 405 nm laser sobre a área três vezes novamente. Repita este passo para todos os ROIs.</li>
	<li>Retornar para o modo "TCS SP8" sobre o software e adquirir uma z-pilha, usando a 561 nm e 488 nm lasers sequencialmente. Certifique-se de selecionar a opção 'bidirecional' para aumentar a velocidade de imagens. Nota: Quanto tempo demora para photoconvert e imagem que varia de cada embrião. Batida do coração é conhecida por ser importante para o desenvolvimento de válvula do coração normal, então evite manter o coração parou durante mais de 30 min, mesmo que isso signifique que você não tem tempo para photoconvert todos os 5 embriões. Nota: Durante o processo de photoconversion, utilizar detectores de PGTO, enquanto após a photoconversion, é recomendável usar detectores de híbrido definidos como 'contando' modo. Isso ocorre porque os detectores híbridos são mais sensíveis e são capazes de produzir imagens de melhor qualidade, mas são facilmente danificados pela superexposição.</li>
</ol>5. desmontar os embriões photoconverted
<ol><li>Depois photoconversion, use uma pipeta de vidro para pressionar para baixo apenas ligeiramente acima da cabeça do embrião para quebrar o agarose LMP e, em seguida, aspire suavemente o embrião.<ol>
<li>Ejete o embrião da pipeta vidro um-35mm de Petri contendo meio de embrião com PTU (para lavar o BDM contendo meio).</li>
		<li>Transferi o embrião para um poço em uma placa de 6 contendo meio de embrião com PTU. Durante esta etapa, certifique-se de manter a nota da qual embrião entra que bem, como isso é essencial para correlacionar a posição de photoconverted células em estádios de desenvolvimento mais tarde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agora que os embriões são removidos do meio contendo BDM, seus corações devem começar a bater novamente em cerca de 5 min. embriões retorno à escuridão a 28,5 ° C, para permitir que os embriões continuar a desenvolver normalmente.</li>
</ol>6. imaging photoconverted células em estádios de desenvolvimento embrionário mais tarde
<ol><li>Na fase desejada, parar o coração e re-inserir os embriões como no passo 3 do presente protocolo, com a importante diferença de que os embriões devem ser tratados com BDM em pratos separados, marcados para rastrear os embriões.</li>
	<li>Para embriões até 62 hpf, adquirir z-pilhas de endocárdio usando 561 nm e 488 nm para o vermelho e verde fluorescente sinaliza, respectivamente. Para os embriões em estágios mais de 62 hpf, use um multiphoton laser conjunto para 940 nm a imagem Kaede verde em vez do 488 nm do laser.</li>
</ol>7. análise de imagem embriões abaixo dos 48 hpf
Nota: Os movimentos de tecido do AVC podem ser difícil analisar devido à sua complexa estrutura tridimensional. Para quantificar o comprimento de uma região de photoconverted no AVC entre duas regiões não-photoconverted ou o comprimento de uma região não-photoconverted no AVC entre duas regiões de photoconverted, pode ser desejável para mapear a estrutura tridimensional em um mapa bidimensional. Imagens de photoconverted embriões obtidos antes 48 hpf pode ser analisado usando o método a seguir.
<ol><li>Importe as imagens adquiridas em Matlab ou qualquer outro software similar.</li>
	<li>Delimitar manualmente o ROI, ou seja, o endocárdio e aplicar uma máscara para remover o sinal fora desta região.</li>
	<li>Aplica um limiar de intensidade na imagem para identificar os pontos no endocárdio e parcela-las em três dimensões. Isole os pontos correspondentes à parte mais estreita e mais reto o AVC, apagando manualmente os pontos de nenhum interesse na aurícula e o ventrículo usando o comando apagar no software.</li>
	<li>Use um cilindro para caber os pontos que representam o AVC então obtido.</li>
	<li>Defina um sistema de referência para comparar várias amostras. Por exemplo, adote o centro de massa dos pontos de AVC como a origem do sistema de referência e o eixo do cilindro equipado como o eixo z.<ol>
<li>Certifique-se de que a positivas z-posições correspondem sempre para o mesmo lado do coração (ventricular ou atrial).</li>
		<li>Os pontos de AVC de projeto no plano x-y e use uma elipse para encaixá-los.</li>
		<li>Rode os endocárdico pontos ao redor do eixo z para o eixo maior da elipse e o eixo y do sistema de referência são paralelas e y-valores positivos correspondem ao lado interno do AVC em relação ao embrião.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para segmentar o AVC, corte o conjunto de dados tridimensional com alguns aviões obtidas através da rotação do metade-plano {y = 0, x > 0} na direção z.<ol>
<li>A intensidade dos pixels vizinhos de projeto nesses planos e definir o endotélio de forma consistente. Por exemplo, retirar manualmente uma linha o atrial ao lado ventricular do AVC em metade da espessura do endotélio.</li>
		<li>Interpole os pontos das linhas que representam o endotélio com uma spline tridimensional usando a caixa de ferramentas spline para representar o AVC com uma superfície. Nota: O número de aviões a corte determina tanto a precisão da segmentação e o consumo de tempo desta etapa. Geralmente, 8 aviões são suficientes para alcançar bons resultados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina a posição azimutal de cada ponto na superfície de AVC usando coordenadas cilíndricas.<ol>
<li>Em cada posição azimutal define uma curva parametrizada ao longo da superfície do AVC, calculando o comprimento do arco na superfície entre pontos consecutivos.</li>
		<li>Para cada curva parametrizada, defina o ponto sobre a curva mais próxima ao centro do AVC para zero. Os pontos do AVC, portanto, são totalmente descritos por sua posição azimutal e sua posição na curva paramétrica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desdobre o AVC em uma imagem bidimensional usando a posição paramétrica dos pontos.</li>
	<li>Encontre as bordas da região para quantificar como as bordas de limiarização a imagem binária a relação entre as intensidades do photoconverted e os canais não-photoconverted. Se necessário, corrigi manualmente o resultado.</li>
	<li>Calcule o comprimento do arco entre as bordas para calcular o comprimento do tecido em função da posição azimutal.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo:+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology.">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li><li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility.">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li><li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+development+of+the+atrioventricular+canal+in+zebrafish.">Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).</li><li>Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+mechanics+in+cardiovascular+development.">Blood flow mechanics in cardiovascular development.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).</li><li>Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics+driven+cardiac+valve+morphogenesis.">Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li><li>Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+and+modeling+for+shear+stress+quantification+in+the+embryonic+zebrafish+heart.">Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart.</a> Methods. , (2015).</li><li>Steed, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=klf2a+couples+mechanotransduction+and+zebrafish+valve+morphogenesis+through+fibronectin+synthesis.">klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis.</a> Nat Commun. 7, 11646 (2016).</li><li>Herwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+cellular+mechanisms+of+blood+vessel+fusion+in+the+zebrafish+embryo.">Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo.</a> Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).</li><li>Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+shear+stress+patterns+predict+the+orientation+of+convergent+tissue+movements+in+the+embryonic+heart.">Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart.</a> Development. , (2017).</li><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development.">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).</li><li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+2,3-butanedione+monoxime+(BDM)+on+Na(+)/Ca(2+)+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes.">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li><li>Pestel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+3D+visualization+of+cellular+rearrangements+during+cardiac+valve+formation.">Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation.</a> Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).</li><li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin.">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton-evoked+color+change+of+DsRed+as+an+optical+highlighter+for+cellular+and+subcellular+labeling.">Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling.</a> Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).</li><li>Dempsey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single-cell+labeling+by+confined+primed+conversion.">In vivo single-cell labeling by confined primed conversion.</a> Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).</li><li>Mohr, M. A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion.">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li><li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins.">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li><li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion.">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li><li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhOTO+zebrafish:+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration.">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).</li><li>Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+tracking+using+PhOTO+zebrafish.">In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).</li></ol>

Não há conflito de interesse declarado.

Calendário de photoconversion: apesar de Kaede permanece brilhantemente expressa em CDE mesmo em 96 hpf, deve-se notar que o embrião cresce, luz laser difunde-se mais antes de atingir o AVC, tornando mais difícil a photoconversion confinado de Kaede. At embrionária dos estágios, o mais tardar 55 hpf, o Balonismo do ventrículo e o átrio também significa que o feixe de laser violeta, usado para photoconversion não pode atingir células de AVC sem primeiro passando o átrio ou ventrículo. Isso significa q...

O peixe-zebra é atualmente um dos mais importantes modelos para estudar processos celulares e do desenvolvimento na vivovertebrados. Isto é principalmente devido a transparência óptica do zebrafish e acessibilidade à genética, o que o torna um poderoso modelo para a aplicação de técnicas ópticas envolvendo geneticamente codificado photoresponsive proteína tecnologias1. Específico para o estudo do desenvolvimento do coração, zebrafish receber oxigênio suficiente através de difusão tal que até mesmo mutantes sem batimento cardíaco podem sobreviver a primeira semana de desenvolvimento, permitindo análises sobre os efeitos de genes de desenvolvimento e perturbado o fluxo de sangue na morfogênese do coração não é possível na maioria dos vertebrados,2.
O tubo de coração zebrafish é formado por 24 horas pós fertilização (hpf). Logo após sua formação, o tubo de coração começa a bater uma ativamente. Por 36 hpf, uma constrição clara separa o átrio do ventrículo. Esta região de constrição é chamado o canal atrioventricular (AVC) e células nessa região de alteração de uma morfologia escamosa a morfologia cuboidal3. Começa a morfogênese zebrafish válvula atrioventricular cerca de 48 h pós fertilização. Por 5 dias pós fertilização, dois folhetos da válvula se estendem até o AVC e prevenir o refluxo do sangue do ventrículo para o átrio durante o ciclo cardíaco4. Rastreamento de células durante a formação de AVC e a válvula é um desafio como a batida rápida do coração torna difícil seguir as células através de microscopia de lapso de tempo tradicional5,6. Este protocolo, adaptado do corcel et al, 20167, descreve um método que usa a Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)zebrafish transgênica linha8 , em que a proteína photoconvertible Kaede é expresso em células endoteliais, incluindo o endocárdio. A droga 2,3-butanodiona-2-monoxime (BDM) é usado para interromper temporariamente o coração batendo, permitindo photoconversion exata de CDE entre 36 e 55 hpf e imagens de alta resolução de photoconverted CDE em pontos específicos de tempo no desenvolvimento. Tem sido mostrado anteriormente que CDE photoconverted usando este método pode permanecer distinguível de seus vizinhos não convertidos por cinco dias ou mais após o tempo de photoconversion7. Este protocolo também detalha um método usado para análise de imagem de photoconverted CDE em menos de 48 embriões hpf, que tem sido usada com sucesso para seguir os movimentos do tecido durante o desenvolvimento de AVC (Boselli et al, no prelo)9. Esperamos que os leitores encontraria este protocolo útil para estudar o desenvolvimento de AVC e válvula em embriões normais e em mutantes, morphants ou embriões tratados com drogas. Para um protocolo mais geral relacionadas com o rastreamento de pilha usando photoconvertible proteínas durante o desenvolvimento do zebrafish, por favor veja o artigo por Lombardo et al, 201210.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 &#215;, N.A. 0.95 objective)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (1-phenyl-2-thiourea)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mg/mL Tricaine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Danieau</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 &#176;C&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M BDM stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 g BDM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium: 30x stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50.7 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.78 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.47 g Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;7487-88-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13477-34-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjust to pH 7.2 and store at room temperature</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasCLEAR resin</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plus 39&#160;Freeform Pico 3D printer</td>
			<td>Asiga</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo

Durante a embriogênese, as células passam por mudanças dinâmicas no comportamento da célula, e decifrar a celular lógica por trás destas mudanças é um objetivo fundamental no campo da biologia do desenvolvimento. A descoberta e o desenvolvimento de proteínas photoconvertible grandemente ajudado nossa compreensão dessas mudanças dinâmicas, fornecendo um método para opticamente destacar células e tecidos. No entanto, enquanto photoconversion, microscopia de lapso de tempo e análise de imagens subsequentes provaram para ser muito bem sucedido na descoberta dinâmica celular em órgãos como o cérebro ou os olhos, essa abordagem geralmente não é usada no coração em desenvolvimento devido à desafios colocados pelo movimento rápido do coração durante o ciclo cardíaco. Esse protocolo consiste de duas partes. A primeira parte descreve um método para photoconverting e posteriormente de rastreamento células endocárdico (CDE) durante zebrafish canal atrioventricular (AVC) e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração. O método envolve temporariamente parando o coração com uma droga em ordem para photoconversion preciso tomar o lugar. Corações são permitidas para continuar batendo em cima da remoção da droga e desenvolvimento embrionário normalmente continua até que o coração está parado novamente para geração de imagens de alta resolução de photoconverted CDE em um ponto mais tarde o tempo do desenvolvimento. A segunda parte do protocolo descreve um método de análise de imagem para quantificar o comprimento de uma região photoconverted ou não-photoconverted no AVC em embriões jovens mapeando o sinal fluorescente da estrutura tridimensional em um mapa bidimensional . Juntas, as duas partes do protocolo permite examinar a origem e o comportamento das células que compõem o zebrafish AVC e válvula cardíaca atrioventricular e potencialmente pode ser aplicado para estudar os mutantes, morphants ou embriões que tenham sido tratados com reagentes que perturbam o desenvolvimento de AVC e/ou válvula.

Um exemplo de um photoconverted de embrião em 48 hpf e fotografada novamente em 80 hpf é mostrado na Figura 2, filmes 1 e 2. Expondo a Kaede a luz de nm 405 irreversivelmente conversos da proteína de sua forma verde fluorescente para formar vermelho fluorescente, permitindo que o comportamento de células rotulado com o verde ou sua forma vermelha para ser seguido com respeitam aos seus diferencialmente coloridas vizinhos ...

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Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Este protocolo descreve um método para o photoconversion de Kaede proteína fluorescente em células endocárdico dos vivos zebrafish embrião que permite o rastreamento de células endocárdico durante canal atrioventricular e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração .

Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K visualizações.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. Este protocolo descreve um método para o photoconversion de Kaede proteína fluorescente em células endocárdico dos vivos zebrafish embrião que permite o rastreamento de células endocárdico durante canal atrioventricular e desenvolvimento de válvula atrioventricular coração .

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Biologia do Desenvolvimento

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Visualizando o Tissue interrenais Steroidogenic e sua Vascular Microenvironment em Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to understand morphogenetic processes is to directly measure cellular forces and mechanical properties in vivo during embryogenesis. Here, we present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, which allows to directly apply forces on cell-cell contacts of the early Drosophila embryo, while imaging at a speed of several frames per second. This technique has the advantage that it does not require the injection of beads into the embryo, usually used as intermediate probes on which optical forces are exerted. We detail step by step the implementation of the setup, and propose tools to extract mechanical information from the experiments. By monitoring the displacements of cell-cell contacts in real time, one can perform tension measurements and investigate cell contacts&#39; rheology.

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

We present a setup of optical tweezers coupled to a light sheet microscope, and its implementation to probe cell mechanics without beads in the Drosophila embryo.

Sondando a célula mecânica com pinça óptica de grânulo-livre no embrião da drosófila

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...