당사의 프로토콜은 생체 내 의 제브라피시 심장을 연구하는 최적화된 도구를 제시하며, 심장 이미징을 위한 데이터 수집 및 분석 파이프라인과 함께 고정 고정 기술을 포함시키는 것을 설명합니다. Zebrafish는 약물 화면과 같은 응용 프로그램에 대한 큰 잠재력을 가진 심장 모델 시스템입니다. 생리적 조건 하에서 부드러운 이미징을 가능하게 하는 프로토콜은 심장 질환을 연구할 때 매우 중요합니다.
여기에 제시된 워크플로우는 제브라피시 배아 심장 화상 진찰에 초점을 맞추고 있지만, 변형된 버전은 오징어, 웜 및 히드라를 포함한 다양한 다른 샘플 및 실험에 적용될 수 있습니다. 원하는 형질대사의 사육으로부터 얻은 배아를 수집하여 시작한다. E3 생선 매체로 채워진 페트리 접시에 배아를 섭씨 28도로 유지하십시오.
마이크로 조작기에 장착하고 피코 인젝터에 연결된 보어 유리 바늘을 사용하여 1 개 또는 두 개의 세포 단계 배아의 노른자에 알파 분가로톡신 mRNA 30 피코그램을 주입하여 물고기를 고정시킵니다. E3 매체로 채워진 페트리 접시에 계란을 섭씨 28도로 유지하고, 24시간마다 계란을 이미징까지 신선한 E3 배지가 들어 있는 새로운 요리로 옮춘다. 안료 형성을 방지하기 위해, 제브라피쉬 배경이 알비노가 아닌 경우, PTU라고도 하는 0.2 밀리몰 티로시나제 억제제 1-페닐 2-티오레아를 함유한 E3 배지를 함유한 새로운 접시로 수정 후 25시간 후 물고기를 이송한다.
불소 에틸렌 프로필렌 튜브를 곧게 펴기 위해 튜브를 유리 또는 강철 오토클레이브 안전 튜브에 넣고 정확한 내직경을 가지며 폴리머 튜브와 오토클레이브를 섭씨 180도에서 2시간 동안 장착한다. 튜브가 실온에 도달하면 곧게 펴진 폴리머 튜브를 제거합니다. 튜브를 청소하려면 50mm 주사기를 사용하여 수산화 나트륨 1 마리로 튜브를 두 번 플러시하십시오.
튜브를 50밀리리터 원심분리기 튜브 크기로 자르고, 수산화나트륨 0.5 mm로 채워진 원심분리기 튜브에 10분 동안 초음파를 투여합니다. 불소 에틸렌 프로필렌 튜브를 이중 증류수로 씻어내면 70%에탄올이 됩니다. 전송 튜브신선한 원심분리기 튜브는 70%에탄올과 초음파를 10분 동안 함유하고 있습니다.
초음파 처리 후, 이중 증류수로 마지막으로 튜브를 플러시하고 이중 증류수를 포함하는 원심분리기 튜브에 보관하십시오. E3 배지에서 낮은 융점 아가로즈를 용해한 후 녹은 아가로즈를 유리 또는 플라스틱 페트리 접시에 부어 1~2밀리미터 코트를 만듭니다. 아가로즈가 고화되면, 건조를 방지하기 위해 천 위에 E3 배지를 부드럽게 붓습니다.
파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에 보관하십시오. 트리카인의 스톡 용액을 해동하고 메틸 블루없이 E3 배지에 0.02 %의 트리카인을 추가하여 포함 매체로 사용하십시오. 일회용 유리 파이펫을 사용하여 물고기를 포함 매체로 옮기습니다.
물고기가 움직이지 못하고 심장이 대조군과 비교하여 비슷한 속도로 뛰고 있는지 확인합니다. 불소 에틸렌 프로필렌 튜브를 면도날로 이상적인 길이로 자릅니다. 무딘 끝 캐뉼라로 주사기를 준비합니다.
주사기를 공기로 채운 다음 튜브를 바늘에 장착하고 주사기를 비우면 남은 물을 부드럽게 씻어냅니다. 다음으로, 주사기에 장착된 불소에 틸렌 프로필렌 튜브를 미디어로 채웁니다. 튜브에 배아를 삽입하여 물고기 머리가 튜브 끝을 닫아 거품 형성을 피하십시오.
면도날을 사용하여 무딘 끝 캐뉼라 또는 바늘의 가장자리에서 튜브를 조심스럽게 잘라냅니다. 한천 코팅 접시 위에 액체를 버린 후 튜브를 한천에 곧장 넣습니다. 튜브를 회전하고 아가로즈 침대에서 플러그를 해제하기 위해 꺼내.
튜브 끝에 있는 한천 플러그의 존재를 확인합니다. 장기 이미징의 경우, 각 추기경 방향에서 튜브에 3~5개의 구멍을 잘라내고, 튜브의 축에 수직으로 면도날을 부착하여 물고기 끝보다 적어도 5밀리미터 를 자르고 장착 매체에 도달할 때까지 30도에서 튜브안으로 절개를 합니다. 그런 다음 180도에서 두 번째 절개를 만들어 구멍을 만들고 튜브를 굴려 컷을 명확하게 시각화합니다.
탑재된 배아를 이미지준비전까지 포함된 매체를 포함하는 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송한다. 샘플 홀더에 튜브를 마운트하고 포함 된 매체로 이미징 챔버를 채웁니다. 샘플 홀더를 챔버에 담그고 시료 홀더를 스테이지에 놓습니다.
심박수를 시각적으로 평가하여 임베디드 생선의 상태를 확인하고 심장 박동이 너무 느리면 샘플을 버리십시오. 재현 가능한 이미징에 항상 동일한 샘플 위치를 사용하고 두 눈이 초점 평면에 있도록 물고기를 회전시하십시오. 그런 다음, 약 20~30도 반시계 방향으로 회전하여 48시간 동안 수정 영상에 대해 서술한다.
물고기가 레이저 전원에 적응했을 때 최고의 이미지 품질을 제공하는 조명 측면을 선택하십시오. 각 Z 평면에서 초당 300프레임 이상으로 4~5개의 하트비트를 기록합니다. 박동하는 심장을 기록하려면 샘플을 라이트 시트를 통해 단계적으로 이동하고 1 ~ 2 마이크로미터의 Z 간격을 사용하여 심장의 전체 깊이를 커버합니다.
4D 파일을 3D 렌더링 소프트웨어에 로드하여 데이터를 탐색하고 렌더링된 제브라피시 하트의 동영상을 생성합니다. 48 시간 후 수정 후 심혼은 막 반복을 겪고 있고 두 개의 챔버, 심실 및 아트리움이 있지만 아직 밸브를 개발하지 않았습니다. 심실, 대실 운하, 아트리움, 유입장 및 유출로와 같은 다른 심장 구조는 쉽게 구별할 수 있습니다.
데이터는 정밀한 박동을 표시하고 심근, 수축 및 생성 힘, 그리고 내카르듐, 혈관에 심혼을 연결하는 단 하나 세포 층 사이 복잡한 상호 작용을 밝혔습니다. 가장 중요한 것은 항상 입체 범위하에서 샘플 건강과 일관된 심장 박동을 확인하는 것입니다. 기존의 기술은 종종 심장 모양이나 기능에 영향을 미치지만, 우리의 방법은 초기 배아 심장의 본질을 이해하는 데 도움이되는 심장박동의 동적 흔들리지 않는 데이터를 제공합니다.
