O Ensaio de Asação da Caixa de Transporte rastreia reproduivelmente a progressão e recuperação do comprometimento cognitivo após um trauma por força bruta ou qualquer outro tipo de lesão cerebral em zebrafish. O ensaio shuttle box permite uma medição relativamente simples, rápida e robusta do aprendizado associativo em memória de curto e longo prazo em zebrafish. Para começar, prepare a Caixa de Transporte modificando uma caixa de gel de 30,5 por 19 por 7,5 centímetros com uma peça de 5 por 19 centímetros de plexiglass de grau de aquário adicionada a cada lado em um ângulo de 45 graus.
Em seguida, faça uma linha marcando o meio do tanque para avaliar quando os peixes cruzaram o meio do tanque. Depois de adicionar 800 mililitros de água do sistema à Caixa de Transporte, coloque dois a três peixes em um tanque de retenção contendo água do sistema. Deixe o tanque na sala escura onde o ensaio da caixa de transporte será realizado.
Em seguida, na sala escura, coloque um peixe no centro da Caixa de Transporte. Fixar a tampa e fixar os eletrodos a uma fonte de alimentação. Os peixes devem ser aclimatados no escuro.
Desligue todas as luzes e aclimata o peixe na Caixa de Transporte por 15 minutos. A aclimatação bem sucedida pode ser considerada quando o peixe explora livremente o tanque. Após a aclimatação bem sucedida do peixe, brilhe manualmente uma lanterna de lente vermelha de 800 lúmens aproximadamente dois centímetros da parede da caixa de gel ao lado ocupada pelo peixe.
Não inicie um teste se o peixe estiver descansando ao lado do fio de platina. Brilhe o estímulo leve diretamente sobre o peixe e siga manualmente qualquer movimento lateral do peixe com a luz para garantir a visualização contínua do estímulo. Continue fornecendo o estímulo leve até que qualquer uma das seguintes condições para um teste bem sucedido ou fracassado seja atendida.
Considere o teste bem sucedido se o peixe atravessar a metade do tanque dentro de 15 segundos de exposição à luz. Uma vez que o peixe cruze a metade do caminho, pare o estímulo leve imediatamente. Se o ensaio falhar, use uma fonte de alimentação eletroforese para aplicar um estímulo de choque negativo de 20 milivolts a um ampere, alternando dois segundos, dois segundos fora por 15 segundos com um máximo de quatro choques ou até que o peixe passe a metade da caixa.
Em seguida, termine tanto o estímulo leve quanto negativo. Antes do período de treinamento, garanta uma aclimatação bem sucedida à Caixa de Transporte deixando o peixe em condições escuras por 15 minutos. Em seguida, brilhe manualmente uma lanterna de lente vermelha de 800 lúmen aproximadamente dois centímetros da parede da caixa de gel ao lado ocupada pelo peixe.
Brilhe o estímulo leve diretamente sobre o peixe e siga qualquer movimento lateral do peixe com a luz para garantir a visualização contínua do estímulo. Enquanto a luz está brilhando sobre o peixe, aplique simultaneamente o estímulo de choque adverso de 20 milívolos a um ampere, alternando dois segundos em diante, dois segundos fora por 15 segundos com um máximo de quatro choques ou até que o peixe passe no meio da caixa. Uma vez que isso seja alcançado, termine a luz e o estímulo adverso.
Repita para 25 iterações. Após a conclusão, permita ao peixe outro período de aclimatação de 15 minutos em condições escuras. Durante o período inicial de testes, realize uma aclimatação bem sucedida na Caixa de Transporte por 15 minutos, em seguida, aplique apenas o estímulo leve por até 15 segundos e registre as respostas.
Considere o teste bem sucedido se o peixe atravessar a metade da Caixa de Transporte dentro de 15 segundos após iniciar o estímulo de luz e parar o estímulo leve imediatamente quando o peixe cruza a metade do caminho. Considere o ensaio como falho se o peixe não cruzar a metade da Caixa de Transporte 15 segundos depois de iniciar o estímulo de luz e parar o estímulo de luz após 15 segundos. Durante os testes iniciais, não aplique um estímulo adverso após uma tentativa fracassada.
Realize testes de memória de curto prazo imediatamente após o período inicial de testes. Induzir lesão cerebral dramática e esperar por um período de quatro horas antes do teste. Em seguida, aclimatar o peixe na Caixa de Transporte por 15 minutos.
Avalie a memória de curto prazo aplicando apenas o estímulo de luz por até 15 segundos e regise se o peixe cruza a metade da caixa antes que a luz seja desligada, considerada como prova passada, ou não cruze a metade dentro dos 15 segundos considerados como teste falho. Repita o passo acima 25 vezes com um período de descanso de 30 segundos entre cada teste e regise o número de testes bem-sucedidos e fracassados. Realize testes de memória de longo prazo quatro dias após os testes iniciais.
Induzir lesão cerebral traumática e esperar por um período de quatro horas antes do teste, em seguida, aclimatar o peixe na Caixa de Transporte por 15 minutos. Avalie a memória de longo prazo aplicando apenas o estímulo de luz por até 15 segundos e regise se o peixe cruza a metade da caixa antes que a luz seja desligada, considerada como prova passada, ou não cruze a metade dentro dos 15 segundos considerados como teste falho. Repita as 25 vezes acima com um período de descanso de 30 segundos entre cada teste e regise o número de testes bem-sucedidos e fracassados.
A visão geral instrutiva dos paradigmas de aprendizagem e memória para avaliação cognitiva é mostrada aqui. O peixe não danificado aos oito meses, adulto jovem, 18 meses, adulto de meia-idade e 24 meses, idoso, exigiu um número semelhante de ensaios para aprender o comportamento de evitar a luz vermelha. Depois de utilizar o modelo de lesão cerebral traumática de força bruta grave, ou STBI, o peixe em diferentes idades exigiu um número semelhante de ensaios para dominar o ensaio em um a cinco dias após a lesão.
No primeiro dia seguinte ao STBI, peixes de todas as idades exigiram um número semelhante de ensaios para aprender o comportamento, que foi significativamente maior do que os controles não danificados. O peixe não danificado rapidamente dominou a Shuttle Box, alcançando cinco testes positivos consecutivos em aproximadamente 17 ensaios, enquanto um dia após uma lesão cerebral leve, ou um TBI leve, os peixes apresentam um aumento significativo no número de ensaios para aprender o comportamento. Esse déficit aumentou após dois TCE leves e foi ainda mais elevado após três leves lesões de TCE.
Peixes intactos apresentam um ligeiro aumento na diferença percentual de ensaios bem sucedidos na memória imediata e memória atrasada em relação ao período inicial de testes. Após um único TBI leve, os peixes apresentaram déficits significativos e imediatos de memória em comparação com peixes não danificados. Essa tendência continuou com repetidas lesões com déficits crescentes após dois TBI leves e três TBI leves.
O tempo de estímulos adversos aplicados é crítico. Emparelhar os estímulos adversos com a luz e sua remoção simultânea solidifica sua associação e é crucial para o paradigma. O ensaio permite uma avaliação rápida ou aprendizado associativo complexo que possa ser usado para investigar impactos do desenvolvimento, do envelhecimento e do meio ambiente no comprometimento cognitivo.
