This work was supported by a Howard Hughes Medical Institute Education Grant and an internal grant from the Saint Joseph's University chapter of Sigma Xi. We would also like to thank the three anonymous reviewers who helped strengthen the protocol and interpretations.

Os seguintes metodologias para a habitação, cuidados, e estudo do peixe-zebra foram aprovados pela Universidade IACUC do Saint Joseph. 1. Zebrafish alojamento e cuidados <ol><li> Obter o peixe-zebra assunto a partir de um fornecedor local, ou a partir de populações selvagens capturados. Por favor, note que a habitação o peixe-zebra está sujeito às diretrizes IACUC e autorizações adicionais são necessários para as populações selvagens capturados habitacionais. </li><li> Identificar e peixe-zebra em separado de acordo com o sexo. Como alternativa, ignore este passo ou substituir com um método diferente de separação com base na hipótese do estudo. NOTA: características sexuais são difíceis de determinar no peixe-zebra, especialmente nas fêmeas. Referem-se a estas diretrizes 10 ou manuais on-line úteis para distinguir o sexo. </li><li> Aleatoriamente separar as populações mais para dentro da proporção apropriada de peixe peixes focal ao estímulo. Nota: peixes Focal são os assuntos de teste seguido através da série de behavioensaios de RAL, e peixes de estímulo são as pessoas que irão ocupar as câmaras de estímulo nos ensaios agressão e empolamento. NOTA: Tradicionalmente, entre 1 e 5 estímulo peixe peixes por focal em ensaios de empolamento e uma mistura 1: estímulo proporção de 1: peixes focal em ensaios de agressão 14,17 são usados. No entanto, o pesquisador precisa projetar especificamente o estudo com a hipótese em mente (ou seja, deve estímulo peixes ser mantida constante para manter a consistência no comportamento dos peixes focal, ou deveria estímulo peixes ser rodado entre cada ensaio para assegurar a randomização adequada). </li><li> Armazenar todos os peixes nas prateleiras habitação peixe-zebra (27,5-28,5 ° C) sob uma 00:12 ciclo de luz / escuridão rigorosa. Alimentar todos os alimentos focal e estímulo peixes floco diária e semanal camarão de água salgada, em dias não-investigação. </li><li> Certifique-se de que todos os testes é feito entre ZT1 e ZT5 (hora zeitgeber) para evitar os efeitos do ritmo circadiano 26. </li></ol> 2. A randomização e tanque de Setup <ol><li> Randomize todos os indivíduos a priori a uma sequência específica de ensaios comportamentais. Configurar um esquema de randomização consistente usando um gerador de seqüência aleatória on-line 27 ou um gerador de seqüência aleatória de um pacote de software estatístico (R). <ol><li> Rotular cada ensaio 1-3 e manter essa atribuição consistente. Atribuir uma sequência aleatória para cada indivíduo e mapear a sequência de acordo com a etiqueta de ensaio comportamental. Por exemplo, para três ensaios totais (1 mapeados para shoaling, 2 mapeado para a ousadia, e 3 mapeados para Agressão), um determinado indivíduo pode ter uma sequência aleatória de &#39;2,3,1&#39;, que vai obrigá-los a realizar o específico ensaios comportamentais na seqüência especificada. </li></ol></li><li> Configurar os tanques de ensaio (ousadia, agressão e empolamento) no laboratório em lugares que minimizam a possibilidade de estímulos externos adversos e certifique-se de ter espaço suficiente para uma câmara de vídeo para capturar todo o tanque. Certifique-se de que a câmara de vídeo enough clareza para ver etiquetas tanque, bem como ser capaz de distinguir comportamentos sutis do peixe focal e configuração da câmara de vídeo nesta posição. </li><li> Grave todos os ensaios comportamentais com a câmera mantida na mesma posição com uma vista completa do tanque especificado para minimizar as diferenças inesperadas na pontuação comportamental, como resultado de gravações diferenciais. NOTA: Evite colocar tanques nas áreas de tráfico pesadas e por portas como o movimento e som irá afetar o comportamento do peixe-zebra. </li><li> Estabelecer protocolos jWatcher únicas 24 por conseguir cada ensaio comportamental. Consulte o manual jWatcher para aprender como criar arquivos mestres focais para atribuir comportamentos a teclas e ficheiros de análise focais para resumir dados coletados. NOTA: jWatcher é software de pontuação comportamental que permite a pontuação comportamental, confiável e repetível personalizado 24. </li><li> Definir um sistema de rotulagem para rastrear a data, número de peixes, e número de ensaio para todos os ensaios comportamentais (por exemplo,&#39;F5-B-123115&#39; implicando Peixe 5, ensaio Ousadia, no dia 31 de dezembro de 2015) e rotular o exterior do tanque com fita em vista e no foco da câmera. Manter e gravar essas informações em um caderno de anotações para referência rápida e controle de qualidade futuro. </li><li> Defina-se um tanque de aclimatação que vai ser utilizada entre todos os ensaios, bem como imediatamente após os indivíduos são retirados da carcaça cremalheira. NOTA: Os tanques de aclimatação e tanques do terminal estão aquários pequenos (40 cm x 20 cm x 25 cm) com cascalho e um filtro que se assemelham a cremalheira habitação. </li><li> Após os ensaios estão todos concluídos, transferir o indivíduo para um tanque de um terminal separado, que servirá como o tanque de destino final para todos os indivíduos focais usados. Use um tanque que é grande o suficiente para abrigar um grupo de indivíduos para o resto de suas vidas (por exemplo, 25 litros). NOTA: É muito importante para manter as temperaturas e condições consistentes e similares água across todos os tanques. Isso inclui habitação, aclimatação, e todos os tanques de teste. </li></ol> 3. Realização do Ensaio Agressão <ol><li> Realizar o ensaio de agressão em um 19 L tanque retangular medindo 30 cm x 15 cm x 10 cm. Equipar o tanque em partições opacas exterior adjacente de três lados do tanque de agressão, deixando exposta a frente para visualização, para reduzir a estímulos exteriores indesejáveis. Divida o tanque com marcações externas em quatro quadrantes iguais retangulares e fixar um espelho permanentemente (com calafetar silicone) no quadrante inferior esquerdo, inclinado a 22,5 ° formando um triângulo direito contra o lado esquerdo do tanque. </li><li> Certifique-se de que a temperatura da água no tanque de depósito de aclimatação e agressão está dentro de 2 ° C da cremalheira habitação. Para fazer isso, ter água fresca e em idade pré-aquecido a 27,5-28,5 ° C pronto para adicionar ao tanque de agressão. Por favor, note que é importante para mudar a água entre cada ensaio para eliminar injustificadapistas olfactivas. </li><li> Transferir, por escavação, um peixe focal da cremalheira carcaça para um tanque de aclimatação separada onde ele vai aclimatar durante 10 min. NOTA: É importante para reduzir estímulos introduzidos para o peixe através do manuseio inadequado. Indivíduos de transferência como descrito anteriormente 27. <ol><li> Especificamente, manualmente e com cuidado colocar um copo de plástico pequena, transparente para o tanque de interesse. Sem interromper o peixe, tanto quanto a transferência usando uma rede, lentamente recolher o peixe no copo. </li></ol></li><li> Certifique-se de que a câmara de vídeo está pronta para gravar, confirmando que o tanque de ensaio de agressão (veja o passo 3.1) está em foco e imediatamente antes de transferir o indivíduo para o tanque de agressão, pressione registro no dispositivo. Transfira o peixe focal através de escavação a partir do tanque para o tanque de aclimatação agressão. NOTA: É importante registrar antes de o pescado que entra no tanque agressão para controlar o tempo exato de entrada. </li><li> Grave a aggrESSÃO tanque durante 10 min e 30 seg e em seguida, o copo de peixe focal do tanque de agressão de volta para o tanque de aclimatação. </li><li> Ao assistir a gravação, espere 30 segundos depois de o peixe foi introduzido para o tanque como um período de aclimatação adicional antes de comportamentos de pontuação. </li><li> Usando o sistema de pontuação jWatcher definido para comportamentos agressivos, quantificar os seguintes comportamentos para 10 min: O tempo gasto perto do espelho, o número de abordagens espelho, número de dardos, número de tentativas de picadas (abertura da boca na direção do espelho), e número de monitores laterais (dorsal, peitoral, anal, e montagem barbatana caudal) 9. </li><li> Marcar um ensaio de agressão única, pelo menos, duas vezes, até que o ensaio é marcado com alta concordância entre as iterações. </li></ol> 4. Realização da Ousadia Assay <ol><li> Conduzir o ensaio ousadia em um pequeno 1.5 L tanque trapezoidal, medindo 15 cm de altura x 26,5 cm x 22,5 cm topo inferior x 6 cm de largura. Enrole papel opaco em torno de todos os lados of do tanque, mas deixar a frente expostos para visualização. Colocar uma peça única, fina de fita externa ao tanque para demarcar o topo da porção inferior do tanque. </li><li> Assegurar que a temperatura da água no tanque é coragem dentro de 2 ° C da cremalheira caixa (ver passo 3.2) </li><li> Transferir o peixe focal da cremalheira carcaça para o tanque de aclimatação (ver passo 3.3) e deixe aclimatar durante 10 min. </li><li> Certifique-se de que a câmera está pronta para gravar o ensaio ousadia e, uma vez pronto para transferir o peixe focal, pressione registro no dispositivo. Transfira o peixe focal do tanque de aclimatação para o tanque de ousadia e recorde de 8 min e 30 seg. </li><li> Ao assistir a gravação, permitir um período adicional de aclimatação de 30 segundos depois de o peixe é introduzido no tanque antes de marcar. </li><li> Usando o software jWatcher, quantificar comportamentos ousadia para 8 min. Especificamente, quantificar os seguintes comportamentos: Tempo perto da superfície, a latência para entrar porção superior, o número de transitions para a parte superior, e número de movimentos erráticos (dardos) 29. </li><li> Marcar um ensaio audácia única, pelo menos, duas vezes, até que o ensaio é marcado com alta concordância entre as iterações. </li></ol> 5. A realização do Ensaio shoaling <ol><li> Conduzir o ensaio shoaling em um tanque de 76 L que tem três compartimentos divididos por dois divisores de vidro selados com silicone calafetar (as resultantes três compartimentos consistem em duas zonas de estímulo e um compartimento focal). Externamente, marcar duas zonas preferenciais designados 6,35 cm de cada uma divisória de vidro nas zonas de estímulo &quot;, indicativo de dois corpos comprimentos 30. Aplicar divisórias opacas externamente em torno de três lados do tanque shoaling, mas deixe a frente expostos para visualização. NOTA: Esta zona de preferência pode ser personalizado para testar hipóteses específicas para diferentes espécies de tamanho. </li><li> Dependendo da natureza do estudo, seleccione cardumes de estímulo a aclimatar durante pelo menos 12 horas antes da suae testar e permanecem no tanque empolamento durante todo o decurso da experiência. NOTA: cardumes estímulo são colecções de peixes individuais que são usados ​​para avaliar a forma como o peixe focal comporta-se na presença ou na ausência desses bancos de areia. Diferentes combinações estímulo cardume pode ser seleccionado para testar um número de diversas hipóteses de empolamento. Certifique-se de que os cardumes de estímulo são rodados entre cada zona de estímulo para evitar viés de lado e também estão autorizados a aclimatar durante pelo menos 12 horas antes do teste. </li><li> Transferir o peixe focal para dentro do tanque de aclimatação como previamente descrito (ver passo 3.3) </li><li> Transferir, por escavação, o peixe focal do tanque de aclimatação intermédia para o compartimento central do tanque de empolamento. </li><li> Permitir para um período de aclimatação de 10 minutos antes de um período de observação live-scoring 10 min. Alternativamente, gravar os ensaios de empolamento e marcar mais tarde usando jWatcher. Os peixes são determinado a ser shoaling quando estão dentro da zona de preferência na câmaraabrigando o cardume alvo. </li><li> Quantificar o tempo gasto em cada zona de preferência e tempo gasto no volume central. </li><li> Como medida descritivas adicionais, calcule &#39;força da shoaling&#39; (SOS). Atribuir um valor entre -1 e +1, onde a magnitude descreve quantas vezes um cardumes de peixes individuais. </li><li> Calcula-se a razão entre o tempo gasto empolamento dividida pela área das zonas de empolamento e subtrair a percentagem de tempo gasto não empolamento e a área das regiões não-empolamento. Coloque esta quantidade através da soma do tempo gasto em cada zona, dividido pelo volume de cada zona individual. Mais informações sobre este cálculo pode ser encontrado em um estudo anterior 14. </li></ol> 6. Controle de Qualidade de Dados <ol><li> Analisar dados usando dados tradicionais ferramentas de análise de 31-32. </li><li> Teste de homogeneidade de variância por meio do teste não paramétrico de Levene para todos os comportamentos. Se um comportamento é não homogênea executar uma log-transformação33. </li><li> Confirmar que não há nenhum efeito de sequência (ou seja, que a ordem de randomização não afectou o comportamento dos indivíduos), utilizando um ANOVA de Kruskal-Wallis nos dados homogéneas 34. </li><li> Confirmar que não há desvios laterais para o ensaio de empolamento criando modelos lineares gerais univariadas em índices SoS com o lado como um fator fixo 35. NOTA: Se houver pouca ou nenhuma problemas com os dados, as análises a jusante pode ser conduzida. Se houver problemas, conciliar com transformações adicionais, racionalizar com explicações biologicamente plausível, e / ou aumentar o tamanho das amostras. </li></ol> 7. Analisar dados <ol><li> Calcule bicaudal de Spearman correlações 36 para todos os comportamentos separadamente nos ensaios de ousadia e agressividade. </li><li> Calcule os coeficientes de correlação intraclasse (CCI) como um modelo misto de duas vias com consistência para ensaios comportamentais que foram realizados mais de um time para um determinado indivíduo 36. Neste cenário, o TPI é uma medida de como consistentemente um peixe comportou-se de um dado ensaio mediu mais de uma vez. </li><li> Preprocess ousadia e agressividade comportamentos de centragem e normatização todos os comportamentos para se preparar para a entrada para a análise de componentes principais (PCA) 25. NOTA: Pré-processamento das medições pela centralização e normatização é um passo vital. Sem este passo de pré-processamento comportamentos que ocorrem com mais frequência e mais variável irá influenciar excessivamente as interpretações dos componentes extraídos. O processo de centralização e normatização irá remover esse viés. </li><li> Execute um APC com uma matriz de correlação para determinar se a ousadia e agressividade estão ligadas entre si como uma síndrome comportamental. Interpretar cargas comportamentais de cada componente significativo em&gt; 0,6. Veja Budaev 2010 24 para um guia completo para relatar PCA para estudos comportamentais. A trama scree vai ser informativo em que eigenvectors deve ser mantido para a interpretação. </li><li> Usando software estatístico, como R ou SPSS 31,32, extrair pontuações para cada componente para cada indivíduo. As contagens representam a quantidade de comportamento do indivíduo dado pode ser explicado por o componente em particular. </li><li> Calcule Spearman correlações entre os escores de regressão de fatores e a força de empolamento 36. NOTA: A síndrome comportamental é considerado presente se ousadia e agressividade comportamentos carregar no mesmo componente ou, se algum componente com cargas interpretáveis ​​significativas correlaciona-se com a força de empolamento. Além disso, observe que a força de shoaling não está incluído no PCA para permitir melhores interpretações das quantificações comportamentais mais complexos (ousadia e agressividade). A APC ortogonalmente colapso ousadia e agressividade apresenta em vectores próprios para maximizar a quantidade de variação explicada e é bem adequado para estas medições complexas. interpretaçãoo que resulta autovetores e regredindo a nossa força de medições empolamento em cada um deles dá uma interpretação muito mais intuitiva de como cada um dos comportamentos complexos (ousadia e agressividade) referem-se a uma medição shoaling binário mais bem definida (ou seja, o peixe é empolamento ou não shoaling). </li></ol>

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P., Krause, J., Couzin, I. D., Pitcher, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+fish+shoals+meet:+outcomes+for+evolution+and+fisheries.">When fish shoals meet: outcomes for evolution and fisheries.</a> Fish Fish. 4, 138-146 (2003).</li><li>Brown, M. B., Forsythe, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Tests+for+the+Equality+of+Variances.">Robust Tests for the Equality of Variances.</a> J Am Stat Assoc. 69 (346), (1974).</li><li>Kruskal, W. H., Wallis, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ranks+in+One-Criterion+Variance+Analysis.">Use of Ranks in One-Criterion Variance Analysis.</a> J Am Stat Assoc. 47 (260), 583-621 (1952).</li><li>Nelder, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+differences+between+individuals+and+two+populations+of+stickleback+(Gasterosteus+aculeatus).">Behavioural differences between individuals and two populations of stickleback (Gasterosteus aculeatus).</a> J Evolution Biol. 18 (2), 464-473 (2005).</li><li>Wilson, A. D. M., Godin, J. -. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boldness+and+behavioral+syndromes+in+the+bluegill+sunfish,+Lepomis+macrochirus.">Boldness and behavioral syndromes in the bluegill sunfish, Lepomis macrochirus.</a> Behav Ecol. 20 (2), 231-237 (2009).</li><li>Brodin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+syndrome+over+the+boundaries+of+life--carryovers+from+larvae+to+adult+damselfly.">Behavioral syndrome over the boundaries of life--carryovers from larvae to adult damselfly.</a> Behav Ecol. 20 (1), 30-37 (2008).</li><li>Noldus, L. P., Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EthoVision:+a+versatile+video+tracking+system+for+automation+of+behavioral+experiments.">EthoVision: a versatile video tracking system for automation of behavioral experiments.</a> Behav Res Methods Instrum Comput. 33 (3), 398-414 (2001).</li><li>Cote, J., Fogarty, S., Weinersmith, K., Brodin, T., Sih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personality+traits+and+dispersal+tendency+in+the+invasive+mosquitofish+(Gambusia+affinis).">Personality traits and dispersal tendency in the invasive mosquitofish (Gambusia affinis).</a> Proc R Soc B. 277 (1687), 1571-1579 (2010).</li><li>Fraser, D. F., Gilliam, J. F., Daley, M. J., Le, A. N., Skalski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explaining+leptokurtic+movement+distributions:+intrapopulation+variation+in+boldness+and+exploration.">Explaining leptokurtic movement distributions: intrapopulation variation in boldness and exploration.</a> Am Nat. 158 (2), 124-135 (2001).</li><li>Dingemanse, N. J., Wright, J., Kazem, A. J. N., Thomas, D. K., Hickling, R., Dawnay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+syndromes+differ+predictably+between+12+populations+of+three-spined+stickleback.">Behavioural syndromes differ predictably between 12 populations of three-spined stickleback.</a> J Anim Ecol. 76 (6), 1128-1138 (2007).</li></ol>

The authors (GW and SPM) have no competing financial interests or conflicts of interest.

O protocolo irá determinar se existem associações consistentes em ousadia, agressão e comportamentos empolamento em peixes-zebra. Se existem associações consistentes numa dada população entre qualquer um destes comportamentos, em seguida, uma síndrome comportamental está presente. Ao estudar a síndrome comportamental de uma população, os pesquisadores podem ter uma compreensão mais completa da sua dinâmica comportamental, estrutura populacional e história evolutiva, possivelmente, 3. Além dis...

Há um crescente corpo de literatura investigando as associações entre comportamentos distintos dentro animais individuais a partir de uma dada população. Estas associações são denominadas síndromes comportamentais, e as medidas incluem, tipicamente, a ousadia, a agressão, o comportamento exploratório, e sociabilidade 1-5. síndromes comportamentais são valiosos tanto por razões diretos e indiretos. Diretamente, o conhecimento das síndromes comportamentais podem fornecer uma visão mais completa da teoria da evolução, estrutura populacional e dinâmica populacional 3. Indiretamente, o conhecimento sobre as associações comportamentais podem informar campos que quantificam o comportamento tais como farmacologia 6, toxicologia 7, genética comportamental 8,9, e endocrinologia 10. Devido a estes benefícios diretos e indiretos, o aumento do conhecimento das síndromes comportamentais é especialmente valioso em organismos modelo comumente utilizados, tais como o peixe-zebra. Estudos utilizando peixes-zebra são encontrados ina variedade de disciplinas, incluindo a análise das síndromes comportamentais 11-13. Para avançar o conhecimento em pesquisa síndrome comportamental, e por outras disciplinas também usam as medidas comportamentais para o teste de hipóteses, descrições confiáveis ​​e sucintas de comportamento são necessários para análises e interpretações válidas e protocolos padronizados irá facilitar as comparações inter-estudo dentro das espécies. Nosso protocolo foi desenvolvido para medir uma síndrome comportamental ousadia-agressão shoaling em uma população de peixe-zebra criados em laboratório 14. No entanto, a base do protocolo (rastreamento de cada peixe, assegurando randomização apropriada, e análises apropriadas) pode ser facilmente modificado para uma variedade de medidas comportamentais alternativos. Além disso, ensaios de ousadia, agressão ou empolamento pode ser executado individualmente para o teste de hipóteses distintas. Portanto, ao mesmo tempo que é o nosso objetivo para descrever como conduzir um estudo de síndrome comportamental eo protocolo para o sucesso l indivíduoEvel medição comportamental, cada faceta deste procedimento pode ficar sozinho. A literatura sobre síndromes comportamentais abarca diversos grupos taxonómicos, de artrópodes e para os seres humanos 4, a fim de medir uma síndrome comportamental, pelo menos dois contextos de comportamento tem de ser quantificados. Infelizmente, muitas vezes há pouca consistência nos ensaios que são utilizados para quantificar a medida de comportamento entre os eixos de comportamento. Por exemplo, no peixe, coragem pode ser medida utilizando ensaios de labirinto em T, ensaios de campo aberto, ou a introdução de um novo estímulo ou externa 15. Estudos de agressão em peixes pode envolver interacções díade, ensaios de vídeo de estímulo, ou ensaios modelo de argila 12,16,17. Da mesma forma, a análise do comportamento de empolamento, que tipicamente envolve a medição de preferência shoalmate, pode ser realizada em diferentes tipos de tanques, com diferentes métodos para determinar o tempo de associação 21-23. Neste protocolo de um subconjunto específico do OveraLL repertório comportamental ensaio é apresentado. Especificamente, este protocolo apresenta uma metodologia para rastrear indivíduos através de ousadia, agressão e ensaios de empolamento de uma forma que facilita as comparações dentro dos indivíduos para determinar se as comparações são consistentes em todos os indivíduos dentro de uma população. Efetuamos este protocolo com o peixe-zebra e ciclídeos condenado (Amatitlania nigrofasciata) em estudos anteriores 14,18, e ele vai trabalhar com qualquer peixes de água doce de tamanho similar. Os ensaios de negrito são conduzidas num tanque trapezoidal 1,5 L que tem uma linha horizontal delinear áreas de igual tamanho das porções superior e inferior do tanque. comportamentos quantificados incluem o número de transições através do teste de peixe entre a parte superior e inferior do tanque, o tempo gasto em cada porção, o número de dardos, e a latência para entrar na porção superior. O ensaio de agressão é realizada num tanque rectangular 19L, que incluium espelho x 5 polegadas 3 polegadas inclinada a cerca de 22 ° situadas no canto inferior esquerdo do tanque 19. Comportamentos quantificados incluem a quantidade total de tempo gasto pelos peixes-alvo interage com o espelho 20, juntamente com indicadores agressivos específicas - número de picadas, displays laterais, dardos entre os peixes de ensaio e de sua reflexão. Para estes indicadores específicos, mordidas são definidos como estocadas rápidas para o espelho com uma boca aberta, displays laterais são definidos como a queima de lateral, peitorais, anal e dorsal barbatanas na direção do espelho, e dardos são quaisquer movimentos erráticos que são não dirigido para o espelho. Finalmente, o ensaio de empolamento quantifica o comportamento de um peixe teste na câmara de centro de um tanque de câmaras-tri. As câmaras laterais do tanque são ou vazio, ou conter uma &quot;cardume target&quot; de peixes, eo tempo o peixe teste gasta perto de cada câmara lateral é medido 21-23. A pontuação composta única, referido como StrenGTH de empolamento (SOS), é calculada para cada peixe de teste individual, específica para os estímulos, e pode ser utilizado em análises a jusante 14. Todos os comportamentos são marcados por um único visor, ou vários espectadores usando software quantificação comportamental livre conhecido como jWatcher 24. Testando a presença de uma síndrome comportamental é principalmente um esforço estatística, e é aconselhável seguir as orientações tal como apresentado pela Budeav 2010 25. Especificamente, recomenda-se realizar uma análise de componentes principais (PCA) em dados centralizados e normalizados em que o entradas são os vetores de comportamentos de um indivíduo em ensaios com múltiplas medidas comportamentais (ie, ousadia e agressividade). A APC, realizado em uma matriz de correlação, reduz a dimensionalidade das medições comportamentais, e assim extrai o conhecimento mais importante que explica a maioria da variação. Os componentes extraídos podem então ser interpretada based em cargas elevadas de factor para o comportamento individual de interesse e pontuações de regressão pode ser extraído para cada indivíduo na base dos componentes explicativas. Estas pontuações de regressão pode, então, ser comparado com a medição SOS e outras várias medições não-comportamentais, tais como o tamanho do peixe ou sexo. Esse fluxo de trabalho foi implementado em um estudo das síndromes comportamentais peixe-zebra em que uma síndrome comportamental específica do sexo que existe entre ousadia e shoaling 14 foi descoberto. Nesta situação, ousadas machos de peixe-zebra são mais susceptíveis de se associar com a espécie de maior dimensão, mais agressivos (D. albolineatus), mas esta associação é perdida nas fêmeas. Esse fluxo de trabalho também foi implementado em um estudo de presidiário kin juvenil ciclídeos (Amatitlania nigrofasciata) 18 em que uma síndrome comportamental não foi descoberto, potencialmente indicando plasticidade comportamental da espécie. Portanto, o protocolo seguinte é apresentada Wom um objectivo de delinear a natureza dos três ensaios específicos (coragem, agressão, e de empolamento), no âmbito de um estudo síndrome comportamental nível individual.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish Rack System</td><td>Aquaneering Inc</td><td>Cat. # ZS550</td><td></td></tr><tr><td>Pet Valu Tropical Fish Food, 224.0 g</td><td>Pet Valu</td><td>Cat. # 31700</td><td></td></tr><tr><td>Premium Grade Brine Shrimp Eggs, 16 oz</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 L Trapezoidal Tank</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>Cat. # itsts-a</td><td></td></tr><tr><td>19 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>211932</td><td></td></tr><tr><td>76 L rectangular tank</td><td>That Fish Place</td><td>212180</td><td></td></tr><tr><td>Hitachi KP-D20A CCD Camera</td><td>Prescott&#039;s, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon AF Nikkor 35-105 mm f/305~4.5s MACRO lens</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ArtMinds Square Mirror, Value Pack 3&quot; x 3&quot;</td><td>Michaels</td><td>Cat. # 10334162</td><td></td></tr><tr><td>Jwatcher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS Statistics Base</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

boldness, aggression, and shoaling assays for zebrafish behavioral syndromes

A síndrome comportamental existe quando comportamentos específicos interagem sob diferentes contextos. Peixe-zebra foram cobaias em estudos recentes e é importante para padronizar protocolos para garantir análises e interpretações adequadas. Em nossos estudos anteriores, temos medido ousadia monitorando uma série de comportamentos (tempo perto da superfície, a latência em transições, número de transições, e dardos) em um tanque trapezoidal 1,5 L. Da mesma forma, nós quantificamos a agressão por mordidas de observação, monitores laterais, dardos e tempo perto de um espelho inclinado em um tanque de 19 L rectangular. Ao dividir um tanque de 76 L em três partes, que também examinou as preferências empolamento. O ensaio shoaling é um ensaio altamente customizável e pode ser adaptado para hipóteses específicas. No entanto, os protocolos para este ensaio também deve ser padronizado, mas suficientemente flexível para personalização. Em estudos anteriores, as câmaras finais eram ou vazio, continha 5 ou 10 peixes-zebra, ou 5 Danios pérola (D. albolineatus). No folmugindo manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado e dados representativos que acompanham aplicações bem sucedidas do protocolo, que irá permitir a replicação de experiências síndrome comportamental.

Dependendo da natureza do estudo, e protocolo específico empregue, vários resultados distintos são possíveis através de uma experiência síndromes comportamentais. As tabelas e figuras, onde indicado a seguir, são adaptados de nosso estudo anterior publicado na revista Behavioural Processes 14 e do jornal Zebrafish 17. Quando a proposta (como descrito acima) é levada a cabo na sua totalidade, dois conjuntos de resultados, &quot;dentro de correlações de ens...

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Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

Arrojo, agressão e Ensaios shoaling para Zebrafish Síndromes Comportamentais

A behavioral syndrome exists when specific behaviors interact under different contexts. Zebrafish have been test subjects in recent studies and it is ...

boldness-aggression-shoaling-assays-for-zebrafish-behavioral

Research

JoVE Journal

Medicine

10.2K visualizações.  Saint Joseph’s University. This manuscript describes the setup, implementation, and analysis of boldness, aggression, and shoaling in zebrafish and testing for the presence of a behavioral syndrome. A standardized approach for behavioral quantification will allow for easier comparison across studies. Modifications to this protocol are possible as each assay can be run individually.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biologia

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of stress-related diseases and psychiatric disorders, yet further studies into the genetic and neuronal regulation of stress are still required to develop better therapeutics. The zebrafish provides a powerful genetic model to investigate the neural underpinnings of stress, as there exists a large collection of mutant and transgenic lines. Moreover, pharmacology can easily be applied to zebrafish, as most drugs can be added directly to water. We describe here the use of the 'novel tank test' as a method to study innate stress responses in zebrafish, and demonstrate how potential anxiolytic drugs can be validated using the assay. The method can easily be coupled with zebrafish lines harboring genetic mutations, or those in which transgenic approaches for manipulating precise neural circuits are used. The assay can also be used in other fish models. Together, the described protocol should facilitate the adoption of this simple assay to other laboratories.

This manuscript describes a simple method to measure stress behaviorally in adult zebrafish. The approach takes advantage of the innate tendency that zebrafish prefer the bottom half of a tank when in a stressful state. We also describe methods for coupling the assay with pharmacology.

Abordagens comportamentais para estudar estresse inato em zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Comportamento

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatizados análises comportamentais de alto rendimento em larvas do peixe

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

Neurociência

The Three-Chamber Choice Behavioral Task using Zebrafish as a Model System

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or cognitive impairment. We have modified and developed a three-chamber choice cognitive task similar to that used with rodents for use with hyperglycemic zebrafish. The testing chamber consists of a centrally located starting chamber and two choice compartments on either side, with a shoal of conspecifics used as the reward. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task at least 8 weeks later. Our data indicate that zebrafish respond robustly to this reward, and we have identified cognitive deficits in hyperglycemic fish after 4 weeks of treatment. This behavioral assay may also be applicable to other studies related to cognition and memory.

We present a behavioral chamber designed to assess cognitive performance. We provide data showing that once acquired, zebrafish remember the task 8 weeks later. We also show that hyperglycemic zebrafish have altered cognitive performance, indicating that this paradigm is applicable to studies assessing cognition and memory.

A Tarefa Comportamental de Escolha de Três Câmaras usando zebrafish como um sistema modelo

Neurodegenerative diseases are age-dependent, debilitating, and incurable. Recent reports have also correlated hyperglycemia with changes in memory and/or ...

Modeling Fetal Alcohol Spectrum Disorders in Zebrafish to Characterize the Impact of an Adverse Embryonic Environment on Adult Social Behavior

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, and cognitive abnormalities are associated with FASD. Social difficulties are common behavioral abnormalities associated with FASD and often result in serious health issues. Animal models are critical to understanding the mechanisms responsible for ethanol-induced social defects. Zebrafish are social vertebrates that produce externally fertilized transparent eggs; these characteristics provide researchers with a precise yet simple procedure for creating the FASD phenotype and an innate behavior that can be leveraged to model the social deficits associated with FASD. Thus, zebrafish are ideal for characterizing the social deficits of FASD. The goal of the current protocol is to provide the user with a simple behavioral assay that can be used to characterize the consequences of a negative environment early during development and the effects it can have on social behavior in adulthood. The protocol can be used to characterize the effect mutations or teratogens have on adult social behavior. The protocol outlined here demonstrates how to characterize the social behavior of individual fish during a 20-min social assay. Furthermore, the data obtained using the current protocol provides evidence that the protocol can be used to characterize the effects of embryonic ethanol-induced social defects in adult zebrafish.

The goal of the current protocol is to outline the steps necessary to establish and use a social preference assay for adult zebrafish and demonstrate that it can be used to characterize ethanol-induced social defects.

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) describe all alcohol-induced birth defects. Birth defects such as growth deficiencies, craniofacial, behavioral, ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

Análise comportamental e fisiológica em um modelo de zebrafish de epilepsia

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Using an Automated 3D-tracking System to Record Individual and Shoals of Adult Zebrafish

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The presented automatic video tracking system accomplishes this by using a mirror system and a calibration procedure that corrects for the considerable error introduced by the transition of light from water to air. With this system it is possible to record both single and groups of adult zebrafish. Before use, the system has to be calibrated. The system consists of three modules: Recording, Path Reconstruction, and Data Processing. The step-by-step protocols for calibration and using the three modules are presented. Depending on the experimental setup, the system can be used for testing neophobia, white aversion, social cohesion, motor impairments, novel object exploration etc. It is especially promising as a first-step tool to study the effects of drugs or mutations on basic behavioral patterns. The system provides information about vertical and horizontal distribution of the zebrafish, about the xyz-components of kinematic parameters (such as locomotion, velocity, acceleration, and turning angle) and it provides the data necessary to calculate parameters for social cohesions when testing shoals.

The use of a 3D automatic video system that can track individual and groups of zebrafish is described. As application example we explore the effects of the NMDA-receptor antagonist MK-801 on shoals of zebrafish.

Like many aquatic animals, zebrafish (Danio rerio) moves in a 3D space. It is thus preferable to use a 3D recording system to study its behavior. The ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Bateria de Testes Comportamentais para Avaliação de Efeitos Neurotóxicos em Peixe-Zebra Adulto

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autor em destaque: Avaliação de mudanças comportamentais ambientais e induzidas por drogas em peixes-zebra adultos 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.