Este trabalho foi apoiado por fundos de Midwestern University College of Health Sciences Research Grant Facilitação adjudicados a EEH e Midwestern University Escritório de Pesquisa e programas patrocinados intramural Grant adjudicados a KJL.

Este protocolo está em conformidade com os princípios de bem estar animal AVMA para o cuidado e uso de animais de laboratório e foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade de Midwestern. 1. Preparação de Anestesia, Equipamento, &amp; Media <ol><li> Dechlorinate aproximadamente 1,5 L de água da torneira usando um agente comercial dechlorinating (disponível em lojas de animais) ou deixando água parada por 24 horas. Obter três taças 1 L e encher cada uma com 500 ml água sem cloro. Rotular um para a realização de peixe antes de qualquer procedimento e outro para a recuperação. Para o terceiro balão, adicionar 100 ug / ml de tricaina metanossulfonato; isso se torna o copo em que os peixes serão anestesiados. </li><li> Encher um tabuleiro raso com gelo, aquecer o meio de cultura (RPMI 1640, 10% de FBS (soro fetal bovino), 50 ug / ml de gentamicina, 100 ug / ml de canamicina, 25 mM de HEPES) à TA, e recolher uma pinça de joalheiro limpo. Pinças limpas por immercante as pontas em etanol a 70% e passar através de um bico de Bunsen, permitindo que o etanol para queimar. </li><li> Decida se o procedimento será realizado sem ampliação, com um, table-top iluminado lupa comercial com 2 - aumento de 10x, ou microscópio de dissecação (totalmente dependente da preferência pessoal). </li></ol> 2. Estabelecer culturas de explantes <ol><li> Pegar o número desejado de peixe e coloque em um copo de exploração. Transferir um único peixe para o copo de anestesia; é melhor para anestesiar peixes individualmente. </li><li> Monitorar os efeitos da anestesia através da observação da natação e de emalhar movimento do peixe. Como anestesia progride, o movimento de emalhar desacelera e os peixes vão nadar de forma irregular e muitas vezes de cabeça para baixo; considerar peixes anestesiados, logo que o movimento de emalhar cessa. Não deixar o peixe por períodos mais longos no banho de anestesia como isto pode resultar na morte do peixe. </li><li> Retire o peixe do copo anestesia e transferênciade gelo, colocando o peixe horizontalmente com o rabo virado para a mão que segurava a pinça. Se experimentou com a técnica e se vários peixes são para ser usados ​​para fazer explantes, considerar a colocação próximo de peixe no copo de anestesia neste momento. </li><li> Para remover as escamas, pinças posição paralela ao peixe com ponta na borda da escala. Deprimir lado plano das pinças ligeiramente para o lado do peixe para fazer com que a escala para elevar a partir do corpo do peixe. Segure escala, com uma pinça, arranque, e lugar (sem inversão) em cultura de tecidos prato. Repetir o procedimento, a remoção de um máximo de 12 escalas de um grande de adultos (6 a partir de cada lado), evitando a região branquial, a linha lateral, e barbatanas. </li><li> Coloque o peixe no copo de recuperação e monitoramento para garantir que ele se recupera dos efeitos da anestesia. Neste momento, o peixe pode ser transferido de volta para um tanque individual. Permitir que o peixe se recuperar durante pelo menos 21 dias para permitir a regeneração de escala completa. </li><li> Dependendo dodelineamento experimental, coloque até 20 escalas por 35 milímetros de plástico tecido tratado com placa de cultura ou 4-6 escalas por prato de vidro de fundo. Permitir escalas para aderir ao prato antes da adição suavemente meios, de modo a não retirar escalas a partir do prato. NOTA: Com experiência, vários peixes podem ser processados ​​antes que a mídia é adicionado ao primeiro prato. </li><li> Adicionar 1,2 ml de meio completo (ver 1.2 acima) para cada 35 milímetros prato. </li><li> Preferencialmente incubar culturas de explantes a 28 ° C em 5% de CO 2 durante o período de tempo desejado, com ou sem tratamento adicional. Alternativamente, incubar as culturas num palco de microscópio aquecida ou dentro de uma câmara de cultura de células vivas por microscopia de vídeo. </li></ol> 3. Brightfield e Vídeo Microscopia <ol><li> Pratos de posição com folhas de celulares para o palco microscópio e, inicialmente, focar utilizando a lente objetiva de 4X. NOTA: Superior ampliações podem ser usadas, dependendo da experiência. Marcando o local docada folha e / ou a orientação do prato sobre o estágio de célula irá facilitar a tomada de imagens ao longo do tempo com as folhas de, aproximadamente, a mesma orientação. </li><li> Retirar pratos da incubadora e fotografia em vários momentos, de acordo com cada protocolo experimental e coloque de volta para a incubadora se apenas imagens estáticas são necessários sobre o período de tempo experimental. </li><li> Durante a realização de microscopia de vídeo, preste atenção ao seguinte: <ol><li> Posicionar o / camada de células emergindo escala dentro do campo de visão tal que a folha de células migrando permanece no campo de visão para a duração do vídeo. NOTA: Este processo pode demorar um pouco de experiência em observar como as células migram de acordo com a escala. Para vídeos de curta duração, esta é uma preocupação menor do que para os vídeos mais longos. </li><li> Para prazos mais curtos, incubar a RT. Para prazos mais longos (18 + hr), use uma fase aquecida ou uma câmara de incubação para manter a temperatura, o equilíbrio do pH, e para minimizar a evaporação da cultura medium. </li></ol></li></ol> 4. Fixação de imunofluorescência Microscopia <ol><li> Preparar e pré-quentes todas as soluções a 28 ° C. Para visualizar keratocytes sob fluorescência, crescer culturas de explantes como descrito acima, utilizando 35 milímetros pratos de cultura de tecidos com fundo de vidro. Alternativamente, usam lâminas de câmara de vidro. </li><li> Adicionar 0,8 ml de 4% de paraformaldeído em 1,1 x PBS a cada prato. Não retire os meios de cultura em primeiro lugar. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, aspirar para remover a solução. </li><li> Adicionar 0,8 ml de 4% de paraformaldeído em 1,1 x PBS a cada prato. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, aspirar para remover a solução. </li><li> A menos que usando ligandos externos ou epitopos externos, permeabilizar as células por adição de 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 em PBS 1X. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min, em seguida, aspirar para remover a solução. </li><li> Adicionar 0,5 mL de BSA a 1% em PBS 1x e incubar durante 1 hora (à temperatura ambiente) ou O / N (a 4 ° C). NOTA: Dependendo das condições experimentais, phalloidin podem ser adicionados neste passo. </li><li> Após a incubação, aspirado para remover a solução e prosseguir com coloração de anticorpos. Alternativamente, armazenar as placas de cultura pela adição de pelo menos 1 - 2 ml de 1% de BSA em 1 x PBS durante 3 - 4 semanas a 4 ° C. </li></ol> 5. Protocolo de imunofluorescência <ol><li> Preparar soluções de anticorpos primários e secundários de acordo com as recomendações do fabricante. NOTA: Se as recomendações do fabricante não estão disponíveis, uma boa diluição de partida de anticorpos primários (em 1% de BSA em PBS 1x) é de 1: 500 de anticorpos policlonais e 1: 1000 para os anticorpos monoclonais; uma boa diluição de partida para os anticorpos secundários é de 1: 1000. Ajuste estas diluições de estoque original obtida a partir do fabricante mais elevada se o sinal é fraco, mais baixa se o sinal é forte e o fundo é um problema. </li><li> Aspirar o BSA a 1% em solução de PBS 1x. Adicionar 0,5 ml de solução de anticorpo primário e incubar durante 1 hora (à temperatura ambiente) ou O / N (a 4 ° C). </li&gt; <li> Remover a solução de anticorpo primário, colocar num limpo e marcado com 1,5 ml de tubo de microcentrífuga, e congelar a -20 ° C. NOTA: Este permite a reutilização do anticorpo primário, se necessário. </li><li> Lavar a cápsula 3-5 vezes com PBS 1x, removendo e descartando o PBS após cada lavagem. </li><li> Adicionar 0,5 ml de solução de anticorpo secundário. Se desejado, adicionar-faloidina fluorescente marcado (a seguir concentração recomendada de qualquer fabricante) durante este passo. Incubar durante 1 hora (à temperatura ambiente) ou O / N (a 4 ° C). NOTA: O uso de faloidina marcada com fluorescência permite a visualização dos filamentos de actina; verificou-se que 488-faloidina etiquetada funciona melhor nos queratinócitos de peixe-zebra, mas outros fluoróforos podem ser utilizados. </li><li> Remova e descarte a solução de anticorpo secundário. </li><li> Lavar a cápsula 3-5 vezes com PBS 1x, removendo e descartando o PBS após cada lavagem. NOTA: O prato pode ser armazenado, coberto de luz, a 4 ° C, se incapaz de view imediatamente; certifique-se de 1x PBS é adicionado ao prato antes de armazenar para assegurar que as células não secam, mas quente até à temperatura ambiente (20 - 30 min), em seguida, remover o PBS imediatamente antes de prosseguir para o próximo passo. </li><li> Quando estiver pronto para observar, adicionar 2 - 3 gotas de um meio de suporte, com ou sem DAPI, dependendo das necessidades experimentais, no prato e deixar repousar durante 10 min à TA. NOTA: Nós usamos um meio de montagem disponível comercialmente, à base de glicerol com DAPI, mas outros meios de montagem podem ser utilizados. 10 min para permitir que o meio de montagem para sentar-se no prato facilita a remoção da lamela de vidro a partir do fundo do prato. </li><li> Após a incubação, apertar suavemente sobre os lados do prato para soltar e remover a lamela. Adicionar uma queda adicional de meio de montagem sobre uma lâmina de vidro e coloque a lamela, células para baixo, para o slide. NOTA: Considere selar a lamela para o slide usando claro unha polonês se a lâmina precisa ser mantido por mais de 1-2 dias. </li><li> Observe a deslizar sob um microscópio de fluorescência. NOTA: A maioria de nossas imagens foram feitas usando uma lente de 40X ou 63X objetivo de imersão em óleo, mas a lente objetiva específica utilizada vai depender do protocolo experimental. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion.">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).</li><li>Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+zebrafish,+Danio+rerio+(cyprinidae),+using+scale+regeneration.">Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration.</a> The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teleost+skin,+an+ancient+mucosal+surface+that+elicits+gut-like+immune+responses.">Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).</li><li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells.">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).</li><li>Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotion+of+Xenopus+epidermis+cells+in+primary+culture.">Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture.</a> Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).</li><li>Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+in+vitro+culture+of+larval+and+adult+epidermal+cells+of+the+frog+Xenopus+laevis.">Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis.</a> In Vitro Cellula., &amp; Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).</li><li>Schober, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+adhesion+kinase+modulates+tension+signaling+to+control+actin+and+focal+adhesion+dynamics.">Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics.</a> The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A etapa mais importante para o sucesso da cultura de ceratócitos explante é permitir que a escala de aderir à placa de cultura para cerca de 2 - 3 minutos antes da adição do meio de cultura. Aproximadamente 75% de escamas irá aderir e crescer folhas (o número de culturas estabelecidas para cada experimento terá de ser ajustado em conformidade). Folhas de queratinócitos não formar em torno de cada escala removido do peixe e colocadas em cultura por vários motivos. Em primeiro lugar, coloração DAPI explantes ...

<html> Estudos da motilidade celular tradicionalmente focada em células que migram individualmente. Queratócitos cultivadas a partir de peixes e explantes de anfíbios têm provado ser um poderoso sistema modelo para estudar os mecanismos de motilidade celular utilizando a modelagem tanto experimental e matemática aproxima 1-6. O trabalho experimental em células migratórias individualmente é auxiliado pelo movimento de deslizamento rápido, suave das células, mantendo ao mesmo tempo uma forma uniforme, a velocidade ea direcção. No entanto, in vivo, as células frequentemente mover-se em conjunto enquanto se mantém junções célula-célula, particularmente durante o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas e metástases. Assim, a migração de células coletivo é uma crescente e cada vez mais importante área de pesquisa no campo da migração celular. A migração coletiva dessas células foi recentemente descrito 7 e tem muitas características únicas que a tornam um poderoso sistema para estudar a migração de células coletiva em um modelo de cicatrização de feridas. ove_content &quot;&gt; Quando as escalas são arrancadas de um peixe-zebra adultos anestesiados, algum tecido epitelial permanece presa à parte inferior da escala. Quando o meio de cultura de células são adicionados, estas células epiteliais, ou ceratócitos, migram rapidamente como uma unidade colectiva a partir da escala. O cultura de explante pode ser visto como um modelo de cicatrização do epitélio da ferida, em que as células migram para longe do explante como fariam através da matriz provisória de um leito da ferida para restabelecer um epitélio intacto. Dados recentes sugerem que esta imita a cultura ex vivo de muitos recursos cicatrização de feridas in vivo em peixes-zebra adultos. taxas de encerramento de feridas 8 traduzir a uma velocidade de migração semelhante ao observado no sistema ex vivo 7. Além disso, num modelo in vivo de ferida cura, o tratamento com varfarina sugere que a hemostase tem nenhum efeito sobre a taxa de cura, enquanto que o tratamento com hidrocortisona, para diminuir a resposta imune não atrase reepitelização 8 </sup&gt;. À medida que o peixe-zebra não sangrar quando a escala é retirado do animal, a hemostase não desempenha um papel importante. Embora tenhamos encontrado células imunes em explantes, que não estudaram os efeitos que possam ter na migração celular coletivo. O protocolo aqui apresentado descreve como estabelecer culturas de peixes-zebra de ceratócitos de explante a assegurar a consistência e reprodutibilidade para utilização em diversos ensaios biológicos. Estas culturas de explantes são particularmente atraente modelo in vitro para a migração celular coletivo por várias razões. Primeiro, keratocytes peixe-zebra são células primárias utilizadas dentro das horas de estabelecimento de culturas de explantes. Portanto, estas células não foram submetidos aos morfológicas e as mudanças de expressão de genes associados com a passagem de pilhas 13/09. Em segundo lugar, este sistema representa um modelo para o estudo de reepitelização de resposta do ferimento 14 e, como parte da resposta a ferimentos, um epitelial para mesênquima transition processo (EMT) é iniciada como evidenciado pelas alterações na expressão de genes e rearranjos do citoesqueleto 14,15. Assim, as alterações na expressão de genes de fundo e a motilidade, que ocorrem em células não tratadas foram caracterizados e fornecer um contexto para interpretar alterações com o tratamento. Além disso, o peixe e a ceratócitos de queratinócitos humanos são funcionalmente equivalente; ambos são as células epiteliais primárias das respectivas espécies e desempenham um papel chave na reparação epitelial. Em terceiro lugar, peixe-zebra adulto estão ganhando reconhecimento como um sistema modelo para uma variedade de doenças humanas 16-18 incluindo melanoma e outros cancros 19-21, cicatrização de feridas cutâneas 8,14 e regeneração de tecidos 22-24. Vantagens técnicas deste sistema modelo são igualmente convincentes. Um número crescente de linhas de mutantes e transgênicos estão disponíveis sem fins lucrativos, instalações centralizadas. Especificamente, a mutação Projecto de peixe-zebra (ZMP) Do Instituto Wellcome Trust Sanger visa criar um alelo nocaute em todos os codificadores de proteínas gene no genoma do peixe-zebra. Actualmente, eles têm mutado 11.892 genes, aproximadamente 45% do genoma, com 24.088 alelos caracterizadas. Além disso, ZMP aceita propostas e irá gerar knock-out gratuitamente. Métodos recentes em knockdown gene em larva e adulto zebrafish 25-28 fornecem flexibilidade para estudar a função de genes developmentally importantes para que as abordagens transgênicas são problemáticos ou impraticáveis. Devido às suas taxas extremamente rápidas de motilidade de ~ 145 mm / h pouco tempo após o estabelecimento de culturas de 29, os ensaios podem ser concluída rapidamente (geralmente em 24 horas ou menos). Como as experiências podem ser concluídos rapidamente e culturas crescem bem à TA, vários dos problemas técnicos associados com os ensaios de migração de células de mamíferos envolvendo microscopia vídeo são evitados. Além disso, na era de apertar os orçamentos de investigação, zebrafish são fácil e barata mantida. A estrutura eo comportamento do explante é complexa. Como os peixes não sangram quando a escala é removida, não é provável que muito mais do que as camadas superficiais da epiderme são removidos com a escala. Queratinócitos parecem ser o tipo de célula predominante na explante, quando escalas são inicialmente removida do peixe, como a grande maioria das células parecem mancha com um anticorpo anti-E-caderina 14. Além disso, não há nenhuma evidência de fibroblastos em cultura inicial, tal como avaliado pela ausência de coloração por imunofluorescência 14 vimentina. No entanto, com a remoção repetida escala, parece haver numerosos neutrófilos no explante (ver vídeo 1). Foram identificadas estas células como neutrófilos com base em observações morfológicas do tamanho, motilidade rapidamente, e a sua migração para fora da camada de células quando expostos a LPS (dados não mostrados). Além disso, essas células manchar sagacidade brilhantementeh um anticorpo de factor de citosólica de neutrófilos, bem como com uma variedade de anticorpos IgG secundários, o que indica que eles têm FcR abundantes na sua superfície (dados não apresentados). Várias camadas de células estão presentes dentro do explante. A microscopia confocal revela a presença de uma única camada de perto o bordo de ataque para mais do que duas camadas de queratinócitos perto da escala com neutrófilos visíveis acima, abaixo, e entre as folhas de ceratócitos de células. Em pontos de tempo iniciais, as células sobre a borda do explante polarizar multi-camada, iniciando a migração de queratinócitos de colectiva a partir do explante a taxas iniciais de ~ 145 mm / h. A área coberta pelo explante aumenta rapidamente, levando a célula de difusão, a tensão no interior da folha, e uma diminuição da velocidade de avanço do bordo de ataque. Interconversões rápidos entre as células líder e do seguidor são observadas no bordo de ataque durante a formação e fecho dos orifícios formados espontaneamente dentro da folha 7. Como oProcesso EMT iniciado com o explante continua, os fragmentos de folhas e as keratocytes perdem sua, motilidade rápida especializada. A expressão genética e alterações morfológicas compatíveis com EMT, cicatrização de feridas, e as respostas inflamatórias ocorrem no prazo de 7 dias de cultura com explantes sendo considerado viável para aproximadamente 10 dias 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:320px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35GC-1.5-14-C</td>
			<td style="width:320px;">1.5 mm&#160; thickness is best for coverslip removal.&#160; 14 mm diameter provides more culture area.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21909-460</td>
			<td style="width:320px;">We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zebrafish keratocyte explants to study collective cell migration and reepithelialization in cutaneous wound healing

Devido às suas propriedades únicas motilidade, ceratócitos de peixe dissociadas a partir de culturas de explantes têm sido usadas para estudar os mecanismos de migração de célula única. No entanto, quando explantes são estabelecidas, estas células também se movem coletivamente, mantendo muitas das características que tornam indivíduo queratócitos um modelo atraente para estudar a migração: as rápidas taxas de motilidade, extensa lamelas ricos em actina com um cabo de actina perpendicular e velocidade relativamente constante e direcção da migração. No início dos explantes, a rápida interconversão de células que migram individualmente com as que migram colectivamente permite o estudo do papel de adesões célula-célula na determinação do modo de migração, e enfatiza as ligações moleculares entre os dois modos de migração. As células em explantes posteriores perdem a capacidade de migrar rapidamente e coletivamente como um epitelial para mesenquimal ocorre e genes associados com a cicatrização de feridas e inflamação são diferencialmente expressos. Assim, os explantes de ceratócitos pode servir como um modelo in vitro para a re-epitelização que ocorre durante a cicatrização de feridas cutâneas e pode representar um único sistema para estudar os mecanismos de migração celular colectiva no contexto de um programa definido de alterações da expressão do gene. Uma variedade de linhas de peixe-zebra mutantes e transgênicos estão disponíveis, o que permite que explantes de ser estabelecida a partir de peixe com diferentes origens genéticas. Isto permite que o papel de proteínas diferentes dentro destes processos a serem endereçados com exclusividade. Os protocolos descritos aqui descrevem um método simples e eficaz para o estabelecimento destas culturas de explantes para utilização numa variedade de ensaios relacionados com a migração de células colectiva.

Como ilustrado na Figura 1, as folhas de queratinócitos pode ser observado a migração para fora de debaixo da escala dentro de horas, que estabelece a cultura de explantes. Ocasionalmente, um queratinócitos migrar individualmente que rompeu com a folha de migrar coletivamente podem ser observados. Além disso, como o explante foi estabelecida a partir de um peixe que tinha sido previamente arrancado, existem neutrófilos abundantes que migram através da folha. Em períodos mais longos de cultura, o...

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Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Ceratócitos Zebrafish migrar em folhas de células a partir de explantes e proporcionam um modelo in vitro para o estudo dos mecanismos de migração celular colectiva no contexto da reparação epitelial. Estes protocolos detalhe uma maneira eficaz para estabelecer culturas de explantes primários para utilização em ensaios de migração de células coletivas.

Zebrafish queratinócitos explantes para estudar migração celular Collective e reepitelização na cicatrização de feridas cutâneas

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

zebrafish-keratocyte-explants-to-study-collective-cell-migration

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K visualizações.  Midwestern University.  Ceratócitos Zebrafish migrar em folhas de células a partir de explantes e proporcionam um modelo in vitro para o estudo dos mecanismos de migração celular colectiva no contexto da reparação epitelial. Estes protocolos detalhe uma maneira eficaz para estabelecer culturas de explantes primários para utilização em ensaios de migração de células coletivas. 

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Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Biologia do Desenvolvimento

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Um dispositivo para executar a migração celular / cicatrização de feridas em uma placa de 96 poços

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Hibridização em Embriões de Zebrafish e Ensaio de Formação de Tubos em iPSC-CEs para estudar o papel da endoglina no desenvolvimento vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Um modelo de Drosophila para estudar poliploidização induzida por feridas

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.