This work was supported by NIH grants R21 HD068949-01 and RO1 GM065303.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a University of Wisconsin - Madison e Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC) (University of Wisconsin - Madison Assurance número A3368-01). 1. Seleção de fêmeas para coleta de ovos via acasalamento Interrompida NOTA: protocolos baseados em FIV contar com a extrusão dos óvulos maduros de fêmeas através de pressão manual 9. protocolos anteriores usaram fêmeas diretamente de tanques ou em acasalamentos de pares sem as fêmeas submetidas comportamento libertação do óvulo, mas apenas uma pequena fração dessas mulheres (cerca de 20% ou menos, dependendo da linha de peixe-zebra) produzem ovos extrudados e competentes sob pressão manual. Em um procedimento melhorado, as fêmeas são pré-classificadas para a postura de ovos por observação visual direta, seguido pela interrupção imediata de acasalamento. Este procedimento é muito eficaz, como quase todas as mulheres pré-selecionados através deste rendimento etapa de acasalamento interrompido ovos extrudados e competentesmediante pressão manual. <ol><li> A tarde antes do experimento, criar pares de acasalamento da estirpe de peixe-zebra desejado em caixas de acasalamento de peixe-zebra padrão. Mantenha homens na mesma câmara como fêmeas ainda fisicamente separadas a partir deles, seja por meio de uma divisão caixa de acasalamento ou colocando o homem sob uma inserção de postura ea fêmea dentro da inserção. </li><li> Na manhã do experimento, remover a partição física, colocando ambos os sexos masculino e feminino na mesma pastilha de postura, de modo que o acasalamento começa. </li><li> Inspecione visualmente os tanques que contêm pares de acasalamento para detectar extrusão de ovos durante o acasalamento natural. Aos primeiros sinais de extrusões de ovo, separado masculina e feminina para interromper a reprodução. Após a separação a partir de machos, fêmeas manter os pré-seleccionado, quer separadamente ou misturadas no mesmo tanque. Use várias fêmeas, dependendo do número de embriões desejados (tipicamente 50-150 ovos / fêmea). </li></ol> 2. Preparar uma solução de esperma NOTA: a fertilização in vitro relies na exposição dos ovos maduros a uma solução de esperma. Esta solução pode ser não tratada, para gerar zigotos diplóides (o qual após tratamento HS2 tornaram embriões tetraplóides) ou UV-tratado, para gerar zigotos haplóides (o qual após tratamento HS2 tornaram embriões diplóides homozigóticos). Esperma protocolos de preparação anteriores sugeriu a utilização de tubos capilares para recolha de sémen a região anal do sexo masculino vivos, mas foi um processo ineficaz uma vez que apenas uma pequena fracção de esperma produziu machos 9. O protocolo apresentado a seguir baseia-se em vez sobre a preparação esperma de testículos dissecados cortadas, que produz resultados mais confiáveis. <ol><li> Preparar a solução de Hank antes do tempo como solução de pré-mistura de um Hank, composto de todos os componentes (Soluções 1, 2, 4 e 5), exceto a solução de bicarbonato de sódio (solução 6). Preparar a solução de 6 fresco e adicionar à pré-mistura da manhã da experiência (Tabela 1). Para fazer a solução de Hanks (solução final, a preparação da manhãprocedimento de fertilização in vitro), misture 990 ul de Premix de Hank e 10 ul da recém-feitos Solução 6. </li><li> Eutanásia machos pela exposição excessiva ao tricaina como uma solução de 0,016% em água condicionado. <ol><li> Prepare tricaina como uma solução de estoque de 0,2% em água (tampão a pH 7,0 com Tris 1M pH 9,0) e manter a 4 ° C. Adicionar 8 mL de uma solução de estoque tricaina por 100 ml de água numa proveta, e utilizar um líquido para transferir os machos à solução tricaina. </li><li> Usar o equivalente de testículos de um macho por embraiagem necessário para ser fertilizado num volume de solução de Hank correspondente a 100 uL para cada macho (por exemplo, os testículos de 10 machos recolhidos em 1 ml de solução de Hank, para fertilizar 10 embraiagens com 100 ul / embraiagem). </li><li> Confirmar eutanásia por cessação de movimentos de emalhar por 15 minutos. Após a eutanásia, remova os machos do copo com uma colher. Lavar os machos brevemente com água condicionada e seque-os levemente, colocando-os brevemente sobre vários locais de umapapel toalha. </li></ol></li><li> Para remover os testículos, primeiros decapitar sacrificados machos usando tesouras de dissecação ou uma lâmina de barbear, e fazer um corte longitudinal ao longo do abdômen com dissecando scissors.Under um microscópio de dissecação com uma fonte de luz refletida, remover os órgãos internos com uma pinça de dissecação. Puxe cada uma das massas testículos com uma pinça e colocá-los dentro do tubo de microcentrífuga contendo solução de Hank. NOTA: Testículos pode ser identificado como cada uma das duas estruturas alongadas de aspecto translúcido encontrados ao lado das paredes do corpo e que convergem perto da cloaca. Testículos pode ficar 2-3 minutos sobre uma superfície da placa de Petri após a dissecação, e antes da sua colocação em solução de Hank. </li><li> Liberar o esperma para a solução por corte dos testículos com uma espátula estreita e / ou cuidado pipetando para cima e para baixo 5-6 vezes os testículos em solução com uma micropipeta 1.000 ul-ponta, evitando a formação de bolhas de ar. Deixar depositar o testículos detritos. </li><li> Guardar a solução de espermatozóides no gelo, onde ele pode manter a sua potência para até 2-3 horas. Se procedendo à luz UV-tratamento de solução de esperma, transferir a solução para um tubo de microcentrífuga limpo deixando as partes de trás dos testículos. </li></ol> 3. Tratamento de UV NOTA: O tratamento de UV é usada para a ligação cruzada de ADN de esperma de modo a torná-lo inactivo no embrião. Este passo só é usado quando a produção de embriões diplóides ginogenéticos haplóides ou homozigotos ginogenéticos. solução de esperma para o tratamento de UV devem ser separados a partir de pedaços de testículos (passo 2.4), como grandes peças podem proteger o esperma de o tratamento com UV. <ol><li> Transferir a solução esperma para um poço seco e limpo de uma placa de vidro depressão sentado em uma cama de gelo (por exemplo gelo dentro de uma placa de petri). Use até 1 ml de solução de espermatozóides por placa de vidro bem. </li><li> Expor a solução de esperma de UV, colocando a placa de vidro depressão no leito de gelo sob uma lâmpada UV. Tratar a solução do esperma para 90 segundos com um 115 V (60 Hz, 0.68A) lâmpada UV em um 19 cm (7,5 polegadas) de distância. Com o fim de uma ponta de pipeta, misturar suavemente a solução cada 30 segundos durante o tratamento com UV (utilizar uma ponta de pipeta limpa a cada 30 seg). </li><li> Usando uma ponta de pipeta limpa e micropipeta, transferir a solução de espermatozóides tratados para um novo tubo de microcentrífuga. Armazenar em gelo até ser necessário para a fertilização in vitro (não mais do que 2-3 horas de extracção). </li></ol> 4. Extrusão manual de óvulos maduros NOTA: As fêmeas obtidas por interrupção do acasalamentos naturais prontamente produzir ovos sob anestesia e pressão manual. Durante este procedimento, o tratamento tricaina deve ser cuidadosamente controlada para evitar a exposição excessiva que pode impedir a recuperação das fêmeas. <ol><li> Anestesiar fêmeas por exposição à luz a solução tricaina: fêmeas de transferência com uma rede de tricaina solução em água condicionado (feita pela adição de 8 ml de tricaina solução stock de 0,2% a 100 ml de água de peixe condicionado) por cerca de 2-5 minutos, até a parada de peixe movimento Gill. </li> &lt;li&gt; Assim que uma mulher interrompe o movimento de emalhar, use uma colher para recolher e brevemente lave-o em água condicionada. Ainda usando a colher para mover o peixe, seque-o levemente, colocando-o brevemente e repetidamente em vários locais de uma toalha de papel, em seguida, transferi-lo para um e seco placa de 10 cm de diâmetro petri limpo. Aproxime-se do peixe com a colher na anterior à direção posterior, para evitar potencialmente danificar o opérculo branquial. </li><li> Use lenços de laboratório ou tecido mole para secar delicadamente ainda mais a área anal, para evitar quaisquer ovos liberados a partir prematuramente sendo ativado pela água. Amortecendo os dedos levemente com água (para evitá-los furando a escamas de peixe), coloque um dedo de uma das mãos nas costas do sexo feminino como suporte, e com um dedo da outra mão aplicar uma leve pressão ao longo do abdômen da fêmea até que os ovos se tornar extrudido. </li><li> Usar uma espátula estreita para mover os ovos para longe do corpo da mulher. Coloque a fêmea de volta em um tanque com água condicionada para a recuperação. <br/&gt; NOTA: Uma vez que os ovos são extrudados enquanto a fêmea está encontrando-se em um lado de seu corpo, ela pode ser capotou e o processo repetido do outro lado dela para obter ovos adicionais. Para garantir a recuperação total da fêmea, aplicam-se apenas pressão manual suave no abdômen, e realizar o procedimento de parada movimento de emalhar para voltar à água em menos de 2 min. </li><li> Ative (com exposição à água) e fertilizar (com esperma solução adição) ovos simultaneamente e dentro de 90 segundos após a extrusão (ver secção 5). </li></ol> 5. Fertilização In Vitro NOTA: a fertilização Zebrafish em cruzamentos naturais é externo, dependente do lançamento simultâneo e ativação por água de óvulos e espermatozóides durante o acasalamento. Em fertilização in vitro imita este processo, expondo os ovos de solução de esperma, na presença de água. volume de água é inicialmente pequena (1 ml), a fim de aumentar a concentração efectiva do esperma. A ligação através de esperma ocorre no prazo de 15-20 seg 10 &lt;/ Sup&gt;, e o volume de água pode, então, ser aumentada. Chorion levantamento contribui ainda mais para a próxima sincronização da embreagem através da limitação da janela para a competência para a ligação dos espermatozóides 11,12. Os embriões resultantes, portanto, exibir ciclos de divisão celular em grande parte simultâneos durante os estágios iniciais de clivagem. <ol><li> Adicionar 100 ul de solução de esperma (correspondente ao equivalente de testículos de um macho - ver Parte 2) para a embraiagem de ovos extrudido sobre uma placa de petri. Agite suavemente a ponta da pipeta usado para adicionar a solução de espermatozóides entre os ovos para misturar o esperma e os ovos juntos, certificando-se de não levantar a ponta da superfície da placa de petri para evitar danos ovo. </li><li> ativar imediatamente os ovos, adicionando 1 ml de solução embrionário médio (E3) (água condicionada também é aceitável como um substituto para a E3 nas partes 5 a 7) e novamente misture delicadamente óvulos e espermatozóides rodando suavemente com a ponta da pipeta. Iniciar um temporizador para iniciar a temporização relativa à adubação. </li&gt; <li> Em 1 mpf no volume de 1 ml, inundar o prato com E3. Antes de continuar, deixe repousar até 10-12 mpf para permitir a ativação do ovo, incluindo a expansão córion completo. </li></ol> 6. O tratamento de choque térmico NOTA: Um choque térmico aplicado no embrião inicial inibe a duplicação centriole, resultando em um complemento incompleto de centrioles para conduzir a formação do fuso durante o ciclo celular subsequente 2. A ausência de fuso por sua vez resulta na falta de formação de sulco 13. <ol><li> Após a expansão das córions (10-12 MPF), despeje os embriões a partir da placa de petri em um coador de chá. Lavar a placa de petri utilizando um frasco de lavagem com E3, a fim de recolher quaisquer embriões restantes no coador de chá. </li><li> Coloque o coador de chá com os embriões dentro de um copo num banho pré-aquecido com E3 a 28,5 ° C. Pré-equilibrar o copo e E3 à temperatura do banho de água e verifique se não há E3 suficiente para que todos os embriões no chácoador são expostos ao meio. </li><li> Aos 22 mpf, remova o coador de chá do banho de água de 28,5 ° C, brevemente apagá-lo em uma toalha de papel para remover o excesso de umidade, e colocá-lo dentro de um copo E3 semelhante pré-aquecido em um banho térmico a 41,4 ° C. </li><li> Aos 24 mpf, transferir o coador de chá de volta para a E3, em banho-maria a 28,5 ° C após uma breve blotting. Aos 29 mpf, use um frasco de lavagem com E3 para transferir os embriões do coador de chá para uma placa de Petri de 10 cm. </li></ol> 7. Seleção de embriões com um One-ciclo Citocinese Stall <ol><li> Durante o período de tempo de 35-45 MPF, sob um microscópio de dissecação com uma fonte luminosa transmitida, seleccionar os embriões que são submetidos a clivagem simétrico na fase de 2 células, e que são, portanto fertilizado. Remover embriões que não são submetidos a clivagem celular. </li><li> Continuar a observar os embriões fertilizados, seleccionados para a divisão celular normal durante o primeiro ciclo celular, e durante o segundoOND ciclo celular (50-65 MPF). </li><li> Classificar os embriões de acordo com as seguintes categorias (Figura 2C): 4 células ( &quot;no box&quot;, no 2: standard arranjo 2 para um embrião de 4 células); 3 células ( &quot;tenda parcial&quot;, em um aberrantes 2 células menores: 1 arranjo de grandes células); 2 e células ( &quot;impasse&quot;, embriões exibindo um atraso do ciclo de uma célula numa mistura 1: 1 arranjo idêntico ao de um embrião de duas células). Organizar os embriões paralisadas em uma placa de petri fresca. NOTA: Nesta fase, embriões no 2: arranjo 2 correspondem àquelas em que durante o segundo ciclo celular nem blastomere sofreu uma tenda divisão celular; embriões em um aberrantes 2 células menores: 1 arranjo de grandes células correspondem àquelas onde de choque térmico causado uma tenda do ciclo celular durante o segundo ciclo celular em um blastomere mas não o outro; e embriões &quot;estagnadas&quot; numa proporção de 1: 1 arranjo correspondem àqueles em que durante o segundo ciclo celular ambos os blastómeros foram submetidos a divisão celular desejadotenda. embriões paralisadas deve retomar a clivagem celular durante o período seguinte do ciclo celular (65-80 MPF). A disposição dos blastómeros podem ser variável, devido aos sinais incompletos do ciclo celular anterior para estabilizar o eixo de 2,14, mas a maioria dos embriões vai formar uma blástula relativamente normal que pode sofrer o desenvolvimento normal. </li><li> Permitir que embriões para desenvolver na placa de Petri, com um limite de 80 embriões por placa de 10 cm. Aos 24 hpf, observar os embriões para determinar se eles têm uma morfologia característica normal dos embriões diplóides diplóides ou homozigóticos 6 (medida normal da extensão do eixo (Figura 3A, 3C)), em contraste com a extensão do eixo reduzida e aumento da espessura da característica corpo de haplóides (Figura 3B)), e / ou avaliar diploidização utilizando marcadores genéticos de pigmento em 36 MPF, tal como ouro ou albino e outros tais ensaios (Figura 3 e ver abaixo) 2,6,9. </li&gt; <li> Remova todos os embriões que parecem ter uma morfologia haplóides, ou que tenham lisadas ou apresentar outros defeitos grosseiramente anormais. NOTA: Se desejar, permitir que os embriões a se desenvolver até 5 dias após a fertilização, continuando a remover embriões lisadas ou grosseiramente anormais em uma base diária e adicionando fresco E3 para refrescar o meio. NOTA: Sobrevivência embriões podem também ser cultivados após a insuflação da bexiga natatória no dia 5 por transferência para um sistema de alimentação e incubação sob condições padrão. </li></ol>

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The authors do not have competing financial interests.

As etapas críticas É fundamental para o trabalho em condições de efetiva em fertilização in vitro. Para garantir um bom suprimento de óvulos maduros (passo 1), as fêmeas configurado para o acasalamento não deveria ter sido criado em cruzes de acasalamento durante pelo menos 5 dias e deve aparecer grávida. Durante a interrupção da reprodução, um observador pode monitorar 15-30 tanques de forma adequada para a primeira aparição de extrusão de ovo natural. Interrupção de acoplam...

Este protocolo permite a manipulação de ploidia de embriões de peixe-zebra, tal como na geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos de haplóides ginogenéticos (Figura 1) ou a produção de tetraplóides. Isto é conseguido através da indução de um atraso na citocinese correspondente a precisamente um ciclo celular (Figura 2A, 2B). O atraso tecla de um ciclo na citocinese é conseguido por tratamento com choque térmico. O protocolo padrão de Choque Térmico (SH) como originalmente descrito por Streisinger e colegas envolvido um impulso de temperatura durante o período de MPF 13-15, resultando em uma tenda a divisão celular de um ciclo durante o primeiro ciclo celular 1. A eficiência deste protocolo foi recentemente melhorado pela digitalização dos ciclos celulares início com uma janela deslizante temporal do tratamento de choque térmico. Esta verificação identificado um ponto de tempo depois de um choque de calor, ainda dentro do primeiro ciclo celular (22-24 MPF), que resulta em uma maior taxa de EMBRyos com uma tenda a divisão celular de um ciclo, que neste caso afecta o segundo ciclo celular 2. A observação de que as manipulações experimentais durante o primeiro ciclo celular interferir com a divisão celular durante o segundo ciclo celular e causar a duplicação do ADN conteúdo também tem sido relatada em outras espécies de peixe 3,4. Referimo-nos a este protocolo modificado como Choque Térmico 2 (HS2 - o termo &quot;2&quot; indica que o impulso de calor ocorre num ponto de tempo mais tarde do que o método HS padrão, e que o atraso do ciclo celular causado por HS2 ocorre durante o segundo ciclo celular ). Estes estudos mostraram que a base de prisão citocinese após o choque térmico é a inibição de duplicação centriole durante o impulso de calor, o que afecta a formação do fuso e indução sulco no seguinte ciclo celular. Resultados HS2 em rendimentos de parada do ciclo celular se aproximando de 100%, e as taxas de ploidia duplicação até 4 vezes superior HS standard 2. sagacidade embriões tratadosha choque térmico durante o ciclo celular blastomere apresentam muitos efeitos deletérios, sugerindo que o choque térmico afeta vários processos necessários para a divisão celular 2. Por outro lado, se o choque de calor é aplicada antes do início do ciclo celular (período de tempo de 0-30 MPF), parece ter efeitos consistentes com interferência específica com a duplicação centriole e não parece afectar outros processos celulares essenciais 2 . Estes estudos mostraram que o tempo antes da iniciação da divisão blastï¿½ero parece ser um período de desenvolvimento passível de choque térmico utilizando como ferramenta para manipular especificamente através da inibição de ploidia centriole. A causa subjacente da aparente selectividade para a choque térmico na duplicação centríolo é desconhecida, mas pode estar relacionada a uma degradação seletiva de subestruturas centrossoma observados em estresse por calor em certos tipos de células, como leucócitos 5. sincronização temporal de embrionáriosenvolvimento é conseguido por fertilização in vitro (FIV). O uso de esperma não tratada durante resultados de fertilização em embriões diplóides que após a HS2 induzidas por um ciclo tenda cytokinesis tornar tetraploid. O uso de espermatozóides tratados com UV, que transporta ligações cruzadas que inativam o seu DNA, resulta em embriões haplóides ginogenéticos 6, que após HSII induzidas por um ciclo cytokinesis tenda tornar diplóides ginogenéticos 2. Devido a toda a duplicação do genoma, resultando, os últimos ginogenéticos diplóides são homozigóticos em cada locus único em todo o genoma. Para concisão, nos referimos a ginogenéticos embriões haplóides como &quot;haplóides&quot; e embriões diplóides ginogenéticos homozigotos como &quot;diplóides homozigotos&quot;. Se viáveis ​​e férteis, diplóides homozigóticos pode ser utilizado para iniciar linhas estéreis e letais-livre. homozygosity direta induzida por HS2 deve também ser facilmente incorporados na análise genética ou telas genéticas, uma vez que diplóides homozigotos de fêmeas que são portadores heterozigotos de Muttaxas de exposição ções de homozigose em altas e fixas (50%) rácios 2. O protocolo a seguir descreve etapas para executar HS2 e induzem a duplicação ploidy com homozigose completa. Para a produção tetraplóide, solução de esperma deve ser tratada. Para a produção de diplóide homozigótica, o esperma deve ser inactivado por tratamento com UV. Além disso, como descrito na discussão, marcadores de pigmentos visíveis pode também ser usado para facilitar a identificação dos diplóides homozigóticos. Companheiro de peixe-zebra, principalmente durante a primeira 3 horas do início do seu ciclo de luz 7, e ambos os adultos e os ovos são sensíveis aos ritmos circadianos 8, portanto, para obter os melhores resultados do procedimento de fertilização in vitro deve ocorrer dentro deste período de tempo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zebrafish mating boxes</td>
			<td style="width:71px;">Aqua Schwarz</td>
			<td style="width:119px;">SpawningBox1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgSO4-7H2O</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine</td>
			<td style="width:71px;">Western Chemical</td>
			<td style="width:119px;">Tricaine-D (MS 222)</td>
			<td>FDA approved (ANADA 200-226)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">77-86-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">920-1</td>
			<td>to prepare 1 M Tris pH 9.0</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fish net (fine mesh) (4-5 in)</td>
			<td style="width:71px;">PennPlax</td>
			<td style="width:119px;">(ThatFishThatPlace # 212370)</td>
			<td>available in ThatFishThatPlace</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic spoon</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in most standard stores</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14091-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:71px;">Dumont</td>
			<td style="width:119px;">SS</td>
			<td>available from Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting stereoscope (with transmitted light source)</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Reflective light source (LED arms)</td>
			<td style="width:71px;">Fostec</td>
			<td style="width:119px;">KL1600 LED</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri plates 10 cm diameter</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf tubes 1.5 ml</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipetteman P-1000</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette tips 1000 &#181;l</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Narrow spatula</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Depression glass plate</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc</td>
			<td style="width:119px;">722085 (Fisher cat. No 13-748B)</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">UV lamp</td>
			<td style="width:71px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">Model XX-15 (cat No. UVP18006201)</td>
			<td>available from Fisher Scientific. Although not observed by us with this model, some UV sources have been observed to experience a decrease of intensity over time (if this is the case, see Modifications and Troubleshooting)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV glasses</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paper towels</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:71px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Timer stop watch</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wash bottle</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24020500</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tea strainer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>available in kitchen stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">beakers, 250 ml (2)</td>
			<td style="width:71px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1000250</td>
			<td>available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water bath (2)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any maker, with accurary to 0.1 C (e.g. Shel Lab H2O Bath Series)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Hanks&#8217; Solution 1</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>8.0g NaCl, 0.4g KCl in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 2</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.358g Anhydrous Na2HPO4, 0.6g KH2PO4 in 100ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 4</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.72g CaCl2 in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 5</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>1.23g MgSO4 &#8729; 7H2O in 50ml ddH2O. Store at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Premix</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>add, in the following order: 10.0 ml Solution 1;&#160; 1.0 ml Solution 2;&#160; 1.0 ml Solution 4;&#160; 86.0 ml ddH2O;&#160; 1.0 ml Solution 5. Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hanks&#8217; Solution 6</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>0.33g NaHCO3 in 10ml ddH2O. Prepare fresh the morning of the IVF procedure.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Solution (final solution)</td>
			<td style="width:71px;">see above</td>
			<td style="width:119px;">see above</td>
			<td>Combine 990ul of Hank&#8217;s Premix and 10ul of freshly made Solution 6 (NaHCO3 solution)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment

Manipulação de ploidia permite transformações úteis, tais como diplóides para tetraploids, ou haplóides para diplóides. No peixe-zebra Danio rerio, especificamente a geração de diplóides ginogenéticos homozigóticos é útil na análise genética, porque permite a produção directa de homozigotos de um único mãe heterozigótica. Este artigo descreve um protocolo modificado para a duplicação de ploidia com base num impulso de calor durante o primeiro ciclo celular, choque térmico 2 (HS2). Através da inibição de duplicação centriole, este método resulta em uma tenda preciso divisão celular durante o segundo ciclo celular. A baia de divisão de um ciclo preciso, acoplado a duplicação DNA afetado, resulta na duplicação do genoma inteiro. Protocolos associados com este método incluem ovo e esperma recolha, tratamento com UV de esperma, fertilização in vitro e pulso de calor para provocar um atraso da divisão do ciclo de uma célula e a duplicação de ploidia. Uma versão modificada deste protocolo pode ser aplicadopara induzir alterações de ploidia em outras espécies animais.

Apesar de a uma célula-box ciclo citocinese, a replicação do ADN ocorre normalmente em tais embriões, o que resulta na duplicação do teor de ADN do embrião (figura 1). O protocolo Streisinger Choque Térmico (HS standard) envolve um pulso de calor durante o período de 13-15 minutos após a fertilização (MPF) e induz principalmente detenção cytokinesis durante a primeira divisão celular embrionária em 35 mpf 1,2, enquanto que o método derivado de...

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies.

Manipulação de ploidia de embriões Zebrafish com choque térmico 2 Tratamento

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

ploidy-manipulation-of-zebrafish-embryos-with-heat-shock-2-treatment

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.9K visualizações.  University of Wisconsin.  Um protocolo modificado para a manipulação ploidy usa um choque de calor para induzir uma tenda de um ciclo na citocinese no embrião. Este protocolo é demonstrado no peixe-zebra, mas podem ser aplicados a outras espécies. 

Vídeo: Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

Geração de parabiótica embriões Zebrafish por Fusion cirúrgica de Desenvolvimento blástulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

Manipulação funcional do gene materno produtos Usando<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação do oócito em Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...