Apresentamos um protocolo para a visualização microscópica eletrônica dos domínios replicativos na célula pela rotulagem EdU do DNA recém-sintetizado e detecção de rótulos com aprimoramento de prata de partículas nanogold e coloração chromEM da cromatina. Este protocolo dá a rotulagem pré-incorporação de alto contraste com fixação tradicional de glutaraldeído que dá a melhor preservação estrutural da cromatina para o processamento da amostra de temperatura ambiente. Este protocolo é otimizado para a célula de adesão que cresce nas tampas na placa de Petri.
Adicione EdU a 10 micro mols de concentração final e coloque as células na incubadora para o tempo de rotulagem desejado. Fixar as células rotuladas com 2,5% de gluaradehidrato em uma solução de cacodilato de sódio de 100 milimoles por uma hora. O tempo de fixação mais longo pode afetar negativamente a rotulagem EdU.
Remova o glutaraldeído enxaguando as amostras com PBS suplementada com cinco milimóculos de cloreto de magnésio, ainda mais considerada como estrela pbs. Lave três vezes por 10 minutos. Membranas plasmáticas permeabilize com 1% de solução de Trione X-100 na estrela PBS, fazem duas alterações por cinco minutos cada.
Esta solução é ainda referida como PBS star T.Lavagem extensivamente a amostra com estrela PBS. Cinco mudanças por cinco minutos cada. Sacie os grupos de aldeídos residuais com 20 milmoles de glicina na estrela PBS, duas vezes por 10 minutos.
Coloque a amostra na estrela PBS com 1%BSA por meia hora. Durante o bloqueio na BSA, prepare o coquetel de reação para detecção da EdU. A ordem de adição de componentes é importante.
A conjugação de biotina-azida da EdU é realizada na câmara úmida para minimizar as mudanças de evaporação e concentração no coquetel de reação. Prepare a câmara úmida. Coloque a mancha de cobertura no para-filme com uma célula voltada para cima e camada 50 a 100 microliters do coquetel de reação no deslizamento de tampas.
A reação leva 30 minutos à temperatura ambiente. Pare a reação lavando a amostra na estrela PBS T, cinco vezes por cinco minutos cada. Bloqueie novamente com 1%BSA na estrela PBS T por mais meia hora.
Prepare a solução streptavidin-Nanogold na estrela PBS T com 1%BSA. Incubar a amostra com streptavidin durante a noite a mais quatro graus em uma câmara úmida recém-preparada. O procedimento é o mesmo da conjugação de biotina-azida da EdU.
Pare a reação e lave a amostra, cinco vezes por 10 minutos cada um com o complexo de estreptavidina de biotina da estrela PBS T.Stabilize por fixação adicional será 1%glutaraldeído PBS estrela por meia hora. Remova o glutaraldeído por lavagem intensa com água deionizada. Saciar grupos de aldeído residual com um miligrama por mililitro de sódio boroidido.
Lave bem de novo. O próximo passo é aumentar o tamanho das partículas nanogold por meio de deposição de prata no curso dourado. Prepare as pré-misturas para minimizar a atividade do quarto escuro.
Equilibre as amostras com tampão de lavagem e vá para uma sala escura. Na sala escura misture os componentes para preparar a solução de lavagem e aplicá-la nas amostras. A solução de pó de acácia é altamente visículos.
Assim, durante a mistura dos componentes, balance o tubo lentamente para evitar a formação de bolhas e espuma. A reação leva de dois a cinco minutos. Recomendamos realizar um teste para determinar o tempo ideal de reação.
O tempo de incubação mais longo pode resultar em um depoimento de prata inespecífico. Para parar a reação, enxágue rapidamente a amostra com três a cinco alterações da água deionizada. Seguido por mais três mudanças por cinco minutos cada.
Para proteger as nanopartículas de prata da dissolução pelo tetroxida de ósmio, incubar as amostras em ácido tetracloroaurico de 0,05% durante dois minutos no escuro. Lave bem com água deionizada. Nesta fase, é adicionado contraste adicional ao DNA contendo material.
Saturar a amostra com a mancha de DNA DRAQ5. Adicione a solução de diamionobenzidina à amostra e incubar por um minuto. Mova a tampa para a placa de petri de fundo de vidro, e coloque-a no palco do microscópio invertido.
Irradiar vários campos de visão com 640 nanômetros de luz vermelha. O painel esquerdo mostra o branqueamento completo da foto do DRAQ5. No painel direito, o mesmo campo de visão é visualizado na luz transmitida mostrando precipitação DAB.
Lave amostras com água deionizada. A próxima etapa deve ser realizada sob o capô da fumaça. Preparado parcialmente reduzido solução de tetroxida de ósmio.
Tenha cuidado. Esta substância é altamente volátil e tóxica. Aplique a solução preparada na amostra.
Nesta fase, os compostos de ósmio reduzidos reagem com depoimentos de diamionobenzidina e aumentam o contraste do DNA. Descarte a solução de contenção de ósmio de acordo com a regulamentação local e lave amostras três vezes por cinco minutos cada. A amostra é ainda mais desidratada em uma série de concentrações crescentes de etanol seguida pela infiltração das células com misturas de resina de etanol.
Substitua a mistura de resina alcoólica por resina pura recém-preparada. Encha o molde de incorporação de tamanho adequado com uma resina recém-preparada. Coloque a mancha de cobertura com uma célula voltada para baixo sobre a cavidade preenchida com resina.
Cure a resina por 24 horas a 37 graus. Em seguida, a 60 graus por pelo menos dois dias. Remova a resina de uma superfície inferior de uma tampa.
Deixe a laje em um nitrogênio líquido e depois transfira para água fervente. O vidro deve se soltar. Repita se necessário.
Os campos de visão irradiados devem ser claramente visíveis devido à deposição diamionobenzidina e à coloração da DAB. Retire a área de interesse da laje usando a serra de corte ou qualquer outro instrumento adequado. Coloque o recorte no suporte simples ultramicroome.
Configure o ultramicrotome para aparamento final do bloco. Usando a lâmina de barbear, prepare o pillet em forma de pirâmide. O tamanho de uma área plana no topo da pirâmide deve ser de cerca de 400 por 200 mícrons.
Monte a pirâmide preparada no braço ultramicroome e instale a faca. Prepare as seções. A espessura da seção pode ser ajustada para atender aos requisitos experimentais.
Nosso objetivo é a tomografia EM. Então preparamos seções com uma espessura de 250 nanômetros também referidas como seções semifinas. Retire as seções da borda da faca e monte-as em uma grade de ranhura.
Usamos uma grade de ranhura, eles estavam em torno de um milímetro para estar ao redor, uma abertura lateral milimétrica. O pequeno tamanho de abertura proporciona melhor estabilidade das seções. Deixe as amostras secarem na rede.
Neste momento, as seções estão prontas para observação. Coloque a grade no suporte da amostra do microscópio eletrônico. Coloque a amostra no microscópio eletrônico.
Adquira séries de inclinação. Os focos de replicação nos núcleos de células mamíferas apresentam padrões distintos de distribuição dependendo da progressão da fase S. A rotulagem edu bem sucedida confirmada pela reação de clique com azida fluorescentemente rotulada demonstra padrão típico de replicação na população de células heterogêneas após a fixação de glutaraldeído no topo.
A rotulagem de streptavidina pode ser influenciada por glutaraldeído. Então primeiro verifique a fluorescência streptavidin manchando sob a mesma condição que streptavidin nanogold na parte inferior. O bom resultado do procedimento de melhorias de prata é uma coloração marrom escura de alguns núcleos e uma mancha de citoplasto amarelo muito desmaio, mostrada na parte inferior.
A vantagem de uma rotulagem pré-incorporação é a possibilidade de selecionar células para a secção. É possível nesta fase porque os padrões de rotulagem se tornam visíveis sob um microscópio de campo brilhante. A rotulagem apropriada resulta nos locais de replicação bem demarcados.
Arrowhead mostrar o DAB manchado fibras de cromatina. A rotulagem de fundo à direita é limitada a algumas nanopartículas por mícndo quadrado. Seções semifinas estão prontas para tomografia e não requerem adição de nanopartículas de ouro.
A abordagem descrita utilizada para os estudos da organização da cromatina em locais com replicação habilitada. Para análise do rearranjo pós-replicativo da cromatina, incluindo imagens de alta resolução da segregação da cromatina. Também foi usado para rotulagem replicada de grandes domínios cromossômicos e estudos de dobra de cromatina de ordem superior e heterocromatina.
Essa técnica de imagem também é importante como ponto de referência para os dados gerados por outras abordagens não microscópicas. O método também pode ser acomodado em estudos microscópicos correlacionados, incluindo técnicas de super resolução. Isso abre novos horizontes em estudos da estrutura de ordem superior da cromatina e sua dinâmica nos vários estados fisiológicos da célula.
