O objetivo geral deste procedimento é demonstrar métodos de dissecção para a perna adulta de Drosophila. Esta técnica remove uma porção da cutícula, expondo o tecido subjacente de uma forma que preserve a arquitetura neuronal e muscular. Este procedimento permite caracterizar a junção neuromuscular para arbors de neurônios motores identificados, utilizando técnicas químicas imunocíticas padrão.
A dissecção é particularmente útil para o estudo de mudanças degenerativas lentas que ocorrem durante períodos relativamente longos de tempo. O aspecto temporal é uma consideração importante, pois a junção neuromuscular bem caracterizada das larvas de Drosophila é estável por aproximadamente cinco a sete dias antes do início da metamorfose. Por outro lado, os neurônios adultos estão presentes ao longo da vida de uma mosca adulta, aproximadamente 90 dias para um melanogaster Drosophila criado em laboratório.
A técnica é flexível e pode ser aplicada a uma gama de genótipos para diferentes modelos de doenças, e utilizar uma gama de anticorpos disponíveis para Drosophila como um sistema modelo. O objetivo geral deste procedimento é demonstrar métodos de dissecção para a perna adulta de Drosophila. Esta técnica remove uma porção da cutícula, expondo o tecido subjacente de forma a preservar a arquitetura neuronal e muscular.
Usando um pincel, transfira moscas para metanol frio em um poço de vidro ou prato por aproximadamente 30 segundos a um minuto. O metanol solubiliza os hidrocarbonetos cuticulares, e as moscas agora podem ser submersas em vez de flutuar em soluções aquosas. Com fórceps, transfira cuidadosamente moscas para a PBS.
Enxágüe três vezes em PBS gelado para remover o excesso de metanol, e mantenha moscas em PBS no gelo até dissecção e fixação. Neste ponto, as moscas devem ser dissecadas e fixadas no menor tempo possível, de preferência menos de 30 minutos. Transfira moscas para um prato de dissecção de elastômero de silicone cheio de PBS frio.
Remova as pernas metatorácicas na coxa usando dois pares de fórceps Dumont número cinco, ou corte as pernas com uma tesoura vannas. Transfira as pernas para um poço em um plástico, 24 placas bem preenchidas com um mil de PBS, e mantenha a placa no gelo até que todas as pernas sejam removidas e transferidas para poços. Normalmente usamos 20 pernas por poço.
Substitua a solução PBS por uma solução FA mililitro e gire em um nutador por 30 minutos. A configuração nutator deve ser definida em uma velocidade média. Certifique-se de que as pernas estão completamente submersas na solução durante este tempo.
Para remover a solução FA, lave em um pbs mil três vezes rapidamente, seguido de três lavagens adicionais por cinco minutos cada em um pbs mil. Segure tecidos em um mil PBS no gelo, antes e durante as etapas de dissecção. Para fornecer uma breve visão geral da anatomia da perna de Drosophila, são indicados os segmentos das pernas, incluindo os segmentos coxa, trochanter, fêmur, tíbia e cinco tarsos.
Aqui vemos uma visão anterior da perna, reconhecida pela presença de cerdas sensoriais em oposição à cutícula nua presente no lado posterior. Também são indicadas a orientação do eixo proximal-distal e do eixo dorsal-ventral. Este procedimento de dissecção remove um pequeno pedaço de cutícula do fêmur proximal, de modo que as arbóreas axon, que projetam dorsalmente, inervando o músculo levator da tíbia, possam ser estudadas.
Nosso trabalho anterior se concentrou na árvore indicada, originária da linhagem de olhos neuroblastos presunçosas. Nesta parte do procedimento, removemos a cutícula do lado anterior do fêmur. As fórceps dissecando são fundamentais para o sucesso, e descobrimos que introduzir uma leve curva no final do número cinco fórceps super finos fornece um chanfrado que permite que a cutícula seja agarrada superficialmente, em vez de ser cutucada, o que pode arruinar o tecido.
Transfira as pernas para um prato de elastômero de silicone na PBS para dissecção. Usando um par de fórceps, fixar o segmento da tíbia no prato de elastômero de silicone, como mostrado aqui no lado direito. Usando as outras fórceps para baixo, pegue um pedaço de cutícula na extremidade distal do fêmur e puxe a direção proximal em direção ao trochanter.
Mantenha metodicamente removendo a cutícula até que o músculo nu seja visível em toda a extremidade proximal do fêmur. Uma vez que todas as pernas são dissecadas, substitua PBS por solução FA para pernas postfix por 30 minutos com agitação em um nutador em velocidade média. Depois, lave as amostras em um mil PBS por três vezes mais rápido e, em seguida, três vezes por cinco minutos cada em solução PBT.
Para bloquear tecidos, substitua um pbt mil por solução de bloqueio consistindo de um soro de cabra mil 5% normal diluído em PBT. Incubar as pernas dissecadas por quatro horas à temperatura ambiente, ou durante a noite a quatro graus Celsius. Remova a solução de bloqueio e substitua por anticorpo primário que é diluído na solução de bloqueio.
Aqui, estamos usando discos anti-discos grandes em uma a 200 diluição. Coloque as placas de volta em um shaker e incubar a quatro graus durante a noite. Após a incubação de anticorpos primários, lave os anticorpos primários em um mil PBT por três vezes brevemente, e depois três vezes por 15 minutos cada.
Bloqueie novamente os tecidos em um moinho 5% soro de cabra normal por pelo menos duas horas em temperatura ambiente, ou durante a noite a quatro graus Celsius. Remova a solução de bloqueio e adicione 300 microliters dos anticorpos secundários fluorescentes diluídos apropriados. Além disso, adicione uma a 2000 diluição de fhalloidina conjugada de fluorescência para rotular músculo.
Para incubar, veda poços com fita de vedação de laboratório e tampa. Além disso, enrole placas em papel alumínio para proteger os fluoroforos da luz. Incubar por seis a oito horas em temperatura ambiente, ou durante a noite a quatro graus Celsius.
Para remover anticorpos secundários desvinculados, realize lavagens com PBT de forma semelhante descrita anteriormente ao lavar anticorpos primários. Após esta etapa, as amostras estão prontas para serem montadas e imagens. Disponha as pernas do lado anterior para cima e cubra com mídia de montagem adicional, se necessário.
Raspe suavemente os cantos de um deslizamento de cobertura através de uma bola de barro. A argila resultante servirá como espaçador entre o escorregador e o deslizamento da tampa, para que os tecidos não sejam esmagados. Pressione para baixo no deslizamento da tampa até que ele esteja tocando a parte superior das pernas.
Sele as bordas com esmalte e guarde a quatro graus até a imagem. Imagem por microscopia confocal usando parâmetros de imagem descritos na seção quatro do protocolo escrito. Para ajudar a validar o protocolo de dissecção, primeiro, imagens de pernas por microscopia de contraste de fase em baixa ampliação.
Aqui está um exemplo no painel A de uma boa dissecação à esquerda, e uma dissecção ruim à direita em que as fibras musculares foram interrompidas. O painel C mostra uma imagem confocal de uma boa dissecação na qual o músculo não foi interrompido. Em contraste, o painel D mostra uma perna danificada durante a dissecção, na qual faltam fibras musculares, conforme indicado pela seta.
Aqui, manchamos uma imagem de pernas com peroxidase anti rabanete para detectar processos neuronais, mostrados aqui em verde, anti discos grandes, o que facilita o agrupamento do receptor de glutamato postino, mostrado em vermelho, e falooidina para rotular músculo, mostrado em azul. Quando capturado na ampliação de 20X com um canal de luz transmitido, é fácil ver a área dissecada. Note que os anticorpos penetram parcialmente em áreas não distincionadas, e podem ser vistos através da cutícula, conforme indicado pela seta branca.
Cada um dos neurônios motores da perna faz projeções estereotipadas ao inervar músculos. Nosso trabalho é focado em neurônios motores inervando o músculo levator da tíbia, mostrado aqui como a região encaixotado e indicado pela seta branca. Em uma ampliação mais alta 60X com zoom 2X no canto superior direito, podemos efetivamente imaginar boutons, mostrados em verde, e DLG circundante mostrado em vermelho.
Aumentar ainda mais o zoom, ou pisar para um objetivo de 100X, permite a quantificação do tamanho de bouton e da morfologia, como mostrado no direito inferior. Usando esta técnica de dissecção combinada com a imunocitoquímica, descobrimos que há um inchaço de bouton dependente de H em um modelo mutante sod1 de ELA, mostrado aqui em pernas H71Y envelhecidas, em comparação com controles do tipo selvagem, como indicado pelas setas. Os tamanhos de Bouton são quantificados no enxame de abelhas à direita.
Encontramos ainda uma redução no marcador de zona ativa Bruchpilot, mostrado em vermelho, dentro de axônios HRP fracamente manchados, mostrados em verde, de mutantes H71Y. Para estudar a neurodegeneração, agregados de proteínasubiquitinadas são frequentemente detectados pelo anticorpo FK2, e mostrados aqui como puncta FK2 positivo, nos axônios e músculos de moscas h71 envelhecidas no lado direito, indicadas pelas setas. Finalmente, mitocôndrias podem ser visualizadas por imunocitoquímica usando um anticorpo monoclonal anti ATP5a, como mostrado aqui em vermelho dentro do músculo levator da tíbia.
Descobrimos que as mitocôndrias se tornam aumentadas com a idade em mutantes H71Y. Uma vez dominada, a preparação da perna dissecada e a coloração de anticorpos associadas permitirão que você analise alterações moleculares na junção neuromuscular adulta para o seu mutante favorecido em vários pontos de tempo.
