Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (número de subvenção MOP 38040) para R.K., Associação de Distrofia Muscular (EUA) para R.K., Famílias de SMA para R.K. e L.M.M, The SMA Trust to T.H.G., e The Muscle Dystrophy Campaign to T.H.G.. L.M.M é um beneficiário de uma Sociedade de Pós-Doutorado da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá, e R.K. é um beneficiário de uma Cadeira de Pesquisa em Saúde universitária da Universidade de Ottawa.

Todos os procedimentos devem ser realizados nos padrões de cuidado animal estabelecidos pela instituição.
1. Dissecção da Musculatura Abdominal do Rato
<ol><li>Antes de começar, compõem 4% de paraformaldeído (PFA). Atenção: Mantenha sempre a PFA dentro de um capô de fumaça e use equipamentos de proteção adequados.</li>
	<li>Eutanize o rato por um método aprovado. Nota: O rato mostrado no vídeo foi eutanizado por overdose de CO2 e luxação cervical. Este mouse é um mouse de 4 semanas de idade em um fundo híbrido CD1/C57Bl6. Este rato foi criado nas instalações de animais da Universidade de Ottawa a partir de ratos que foram originalmente comprados.</li>
	<li>Faça uma incisão inicial através da pele ao nível do quadril e corte através da pele todo o caminho ao redor do rato.</li>
	<li>Retire a pele, puxando para cima até atingir o nível do membro dianteiro.</li>
	<li>Corte a musculatura abdominal ao nível do quadril e continue a incisão até chegar à coluna vertebral.</li>
	<li>Neste ponto, comece a cortar para cima através da musculatura e das costelas até chegar ao membro superior.</li>
	<li>Corte em linha reta até chegar à coluna vertebral do outro lado.</li>
	<li>Corte para baixo até chegar ao ponto em que começou.</li>
	<li>Libere o diafragma por baixo (tomando cuidado para não danificar o músculo TVA) e coloque-o em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) em um prato de dissecção revestido de SYLGARD com pinos de dissecção de 0,2 mm.</li>
	<li>Fixar a caixa torácica e a musculatura associada no prato, lado superficial para cima, certificando-se de que o músculo está totalmente esticado.</li>
	<li>Despeje o PBS 1x e substitua por 4% de PFA.</li>
	<li>Cubra e deixe em uma plataforma de balanço em temperatura ambiente por 15 minutos.</li>
	<li>Lave 3x em 1x PBS em temperatura ambiente por 10 minutos.</li>
</ol>* Neste ponto, os músculos fixos podem ser deixados em uma geladeira durante a noite antes da dissecação subsequente.
2. Isolamento do Músculo TVA
<ol><li>Para proceder com o isolamento do músculo TVA, sob um microscópio de dissecção, comece cortando o músculo oblíquo externo ao nível das últimas costelas (Ver Figura 1 para um guia anotado).</li>
	<li>Corte direto para baixo ao lado da linhaa alba (tomando cuidado para não cortar através do TVA abaixo) até chegar ao início do músculo oblíquo interno.</li>
	<li>Em seguida, corte para liberar o reto abdominis sobreposto e os músculos oblíquos externos da parte superior do TVA abaixo.</li>
	<li>Remova o vaso sanguíneo e qualquer gordura excessiva do músculo TVA.</li>
	<li>Solte o músculo da última costela.</li>
	<li>Corte em torno das margens do músculo e remova para uma placa de 24 poços contendo PBS.</li>
</ol>3. Rotulagem imunofluorescente e microscopia do músculo TVA
Para todas as etapas subsequentes, remova o líquido usando uma pipeta fina e deixe a placa em uma plataforma de balanço. Salvo previsão em contrário, todas as etapas subsequentes são realizadas à temperatura ambiente.
<ol><li>Incubar em PBS contendo 1:1.000 bungarotoxina fluorescente marcada por 30 minutos para rotular os NMJs. Isso pode ser feito em uma sala escura ou sob papel alumínio.</li>
	<li>Músculo permeabilize adicionando 300 μl por poço de 2% Triton X-100 em PBS e deixe em uma plataforma de balanço por 30 minutos.</li>
	<li>Incubar no reagente de bloqueio (4% BSA, 1% Triton na PBS) por 30 min.</li>
	<li>Incubar no bloqueio de reagente contendo anticorpos primários (neurofilamento 1:100; proteína de vesícula sináptica 2, 1:250) a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Lave 3x em 1x PBS.</li>
	<li>Incubar em PBS contendo 1:250 anticorpo secundário por 2-4 horas.</li>
	<li>Lave 3x em 1x PBS.</li>
	<li>Monte os músculos em lâminas de vidro usando mídia de montagem fluorescente suficiente e deslizamento de cobertura.</li>
	<li>Slides são melhor visualizados usando um filtro de passe de banda dupla em um microscópio epifluorescente padrão.</li>
	<li>Os NMJs são melhor imagens usando uma projeção da série Z em um microscópio confocal equipado com pelo menos um objetivo de 40X.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste vídeo, detalhamos um protocolo para a dissecção do músculo TVA do camundongo e para a rotulagem imunofluorescente de montagem total de NMJs dentro do músculo. Também apresentamos dados que mostram que este músculo pode ser usado para analisar a patologia da junção neuromuscular em um modelo de camundongos de SMA.
O sucesso nesta técnica depende de uma série de fatores. Alguns dos problemas mais comuns estão descritos abaixo. Em primeiro lugar: má coloração imunohistoquímica. Pode haver uma série de razões para isso, uma das mais comuns sendo o uso de diferentes reagentes para os listados neste protocolo. Um PFA de alto grau de microscopia eletrônica é muito importante para garantir uma boa coloração, assim como a escolha de anticorpos listados neste protocolo. Além disso, em animais mais velhos (ou seja,> 3 meses), obter uma boa qualidade de coloração pode ser mais difícil. Isso se deve ao aumento da espessura da fáscia em torno do músculo e ao aumento do acúmulo de gordura entre o oblíquo externo e o tranversus abdominis. É importante retirar a gordura, antes de proceder à imunofluorescência. Também pode ser necessário tirar parte da fáscia cobrindo o músculo, que pode ficar engrossado. Às vezes é difícil tirar a fáscia e a gordura do músculo sem incorrer em algum dano à fibra muscular e uma interrupção do padrão de inervação. No entanto, se essa técnica for realizada com cuidado, a coloração de boa qualidade pode ser adquirida de camundongos até pelo menos 1 ano de idade. Em camundongos mais jovens (ouseja, menos de 3 meses de idade) não deve ser necessário realizar qualquer provocação ou separação de fibras musculares. Em segundo lugar: difícil encontrar NMJs após dissecação e coloração. Isso ocorre muitas vezes porque a dissecção não se estendeu por baixo da última costela. A maioria dos NMJs estão localizados logo abaixo da última costela e, portanto, devem ser tomados cuidados para garantir que esta parte do músculo seja incluída na dissecação. Em terceiro lugar: a adesão do músculo EO ao músculo TVA. Esta é frequentemente uma queixa quando os indivíduos tentam estender a dissecção abaixo do nível do músculo oblíquo interno (IO). A área do músculo TVA onde o IO também está presente é mais difícil de analisar, pois pode ser difícil distinguir qual músculo é qual. Por essa razão, nós rotineiramente apenas dissecamos a parte mais superior do músculo TVA. Neste nível, não há adesão entre os músculos EO e TVA e, portanto, este não deve ser um problema significativo.
Um obstáculo significativo para o uso do músculo TVA, comparado aos músculos appendiculares, é a acessibilidade para manipulações cirúrgicas ou injeção de substâncias. Esses tipos de experimentos podem ser cruciais para investigar a fisiologia do NMJ em um determinado músculo. Embora o TVA seja certamente menos facilmente acessível do que os músculos mais comumente utilizados, como tibialis anterior ou gastrocnemius,trabalhos anteriores mostraram que é possível denervar o TVA por lesão cirúrgica dos nervos intercostais18. Recentemente também usamos este músculo para a administração local de substâncias sob anestesia geral (dados inéditos). Embora esses experimentos possam representar um desafio técnico moderado, este trabalho mostra que eles são viáveis e, portanto, estendem a utilidade desse músculo para análise de NMJs sob manipulação patológica e fisiológica.
O músculo TVA é um dos vários músculos planos finos situados em todo o corpo que podem ser usados para análise completa dos padrões de inervação. Outros músculos incluem um grupo de músculos cranianos inervados por neurônios motores originários do núcleo facial do tronco cerebral, abrangendo levator auris longus, auricularis superiore adutor auris longus, as dissecções para as quais foram descritas anteriormente14,19. Além disso, a musculatura em torno do músculo TVA, incluindo EO, IO e reto abdominis,também pode ser rotulada e usada para análise de NMJ. Para uma análise abrangente da patologia NMJ em um modelo de camundongo, é importante considerar uma série de músculos situados em todo o corpo e não restringir a análise a um único músculo. Isso é exemplificado em modelos de camundongos de doenças do neurônio motor onde há heterogeneidade significativa nos níveis de patologia do NMJ entre diferentes músculos20. Essa variabilidade intermuscular é uma ferramenta extremamente valiosa ao investigar o mecanismo de vulnerabilidade do neurônio motor e, portanto, restringir a análise a um único músculo poderia diminuir significativamente o potencial da pesquisa.

As junções neuromusculares (NMJs) são a conexão sináptica entre um neurônio motor inferior e uma fibra muscular esquelética. São tradicionalmente consideradas uma sinapse tripartite, composta por um neurônio (terminal pré-sináptico), fibra muscular (terminal pós-sináptico) e célula schwann terminal1. Os NMJs parecem ser alvos precoces e significativos na patologia em uma gama de doenças de neurônios motores e modelos de camundongos2,3. Os sintomas típicos incluem a denervação, onde a placa final do motor torna-se desprovida de uma inervação pré-sináptica, inchaço do terminal pré-sináptico e redução da complexidade da morfologia NMJ4-11. Também podem ser observadas respostas compensatórias, que incluem brotação terminal e nodal, onde os processos axonais se estendem desde terminais sinápticos remanescentes ou internos até placas endervadas reinnervadas12,13. Devido à correlação apertada entre a atividade sináptica e a morfologia do NMJ, uma grande quantidade de informações pode ser obtida sobre o estado funcional dos neurônios motores a partir da análise da morfologia NMJ. Como a perda de NMJs representa frequentemente um dos primeiros aspectos da patologia neuromuscular4,10, a quantificação ao nível da inervação pode dar informações importantes sobre a progressão da patologia e o efeito potencial de uma intervenção terapêutica. Além disso, como a perda do NMJ representa um passo significativo na progressão patológica, o desenvolvimento de terapêuticas que possam estabilizar as conexões e incentivar a regeneração pode gerar benefícios significativos.
Ao analisar a morfologia do NMJ, a escolha muscular é de grande importância. Algumas das considerações primárias podem incluir tipo de fibra muscular, posição corporal e análise comparativa às condições humanas. Além disso, quando são necessárias manipulações como injeção de substâncias ou lesão nervosa traumática, a acessibilidade experimental também é importante a considerar. Em geral, é preferível analisar uma gama de músculos posicionados em todo o corpo refletindo uma gama de subtipos de unidade motora. Muitas vezes, no entanto, a escolha muscular é influenciada pela facilidade de dissecção. Consequentemente, a análise do NMJ é frequentemente realizada exclusivamente em grandes músculos appendiculares, como gastrocnemius. Para obter uma boa coloração de NMJ nesses músculos, seccional ou interrupção mecânica das fibras musculares é frequentemente necessário. Como resultado, o padrão de inervação pode se tornar interrompido e uma análise abrangente e de alta qualidade dos padrões de inervação, brotando e denervação é frequentemente comprometida. Uma abordagem alternativa é usar músculos planos finos que não requerem secção e podem ser manchados e montados intactos, permitindo uma visão geral abrangente de toda a inervação do músculo. Há uma série de músculos que podem ser usados para tal análise, incluindo um grupo de músculos cranianos, (englobando levator auris longus, auricularis superior, e adutor auris longus)14, músculos torácicos (por exemplo. triangularis sterni) 15, e músculos abdominais(por exemplo, transversus abdominis (TVA)). O maior obstáculo no uso desses músculos é a perícia técnica necessária para dissecá-los sem danos.
Neste vídeo, fornecemos um protocolo para dissecar e realizar rotulagem imunofluorescente do músculo TVA do camundongo para permitir uma análise abrangente do padrão de inervação e morfologia NMJ. O músculo TVA é um músculo de contração predominantemente lento que compreende a camada mais profunda de musculatura abdominal e é inervatado pelos nervos intercostais inferiores. Trabalhos anteriores mostraram ser consistentemente altamente vulnerável à patologia em uma série de modelos de camundongos da doença do neurônio motor infantil atrofia muscular espinhal (SMA) e em outros modelos de camundongos de degeneração de neurônio motor de início precoce4,16. Por conseguinte, sugerimos que o TVA é um músculo útil para a realização da análise de NMJ em neuropatias periféricas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

A análise da morfologia da junção neuromuscular pode dar uma visão importante do estado fisiológico de um determinado neurônio motor. A análise de músculos planos finos pode oferecer vantagem significativa sobre os músculos mais grossos tradicionalmente utilizados, como os do membro traseiro (por exemplo. gastrocnemius). Os músculos finos permitem uma visão geral abrangente de todo o padrão de inervação para um determinado músculo, o que, por sua vez, permite a identificação de piscinas seletivamente vulneráveis de neurônios motores. Esses músculos também permitem a análise de parâmetros como tamanho da unidade motora, ramificação axonal e broto terminal/nodal. Um obstáculo comum no uso desses músculos é ganhar a expertise técnica para dissecá-los. Neste vídeo, detalhamos o protocolo de dissecação do músculo transversus abdominis (TVA) de camundongos jovens e a realização de imunofluorescência para visualizar axônios e junções neuromusculares (NMJs). Demonstramos que essa técnica dá uma visão completa do padrão de inervação do músculo TVA e pode ser usada para investigar a patologia do NMJ em um modelo de camundongo da doença do neurônio motor infantil, atrofia muscular espinhal.

O protocolo acima direciona o isolamento e a coloração do músculo TVA para análise de NMJ. Isso permite a análise completa dos padrões de inervação muscular, bem como a análise de alta resolução da morfologia NMJ(Figura 2). Essa técnica pode ser aplicada com sucesso para revelar a patologia do NMJ em modelos de camundongos da doença do neurônio motor, como a SMA4,17(Figura 3). Nos modelos de camundongos de SMA há variabilidade intramuscular significativa na patologia, porém o músculo TVA é consistentemente altamente afetado. Isso é evidenciado pela denervação de placas finais motoras, acúmulo de neurofilamentos no terminal pré-sináptico e broto terminal(Figura 3). Os resultados aqui apresentados demonstram que a técnica descrita acima pode ser um método poderoso para fornecer uma visão geral abrangente da inervação e análise da patologia NMJ em modelos de camundongos.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> Figura 1. Visão geral da musculatura abdominal do rato. (A) A imagem mostra a gaiola torácica com musculatura abdominal anexada, que foi removida de um rato recentemente eutanizado e presa em um prato de dissecção superficial para cima(A). (B) A dissecação em A foi anotada para marcar os limites aproximados dos músculos abdominais. Os músculos abdominais superficiais podem ser vistos no lado esquerdo da dissecção, e incluem oblíquo externo (delineado em azul) e reto abdominis (delineado em vermelho). No lado direito da dissecção, os músculos superficiais foram removidos permitido visualização do músculo transverso abdominis (delineado em verde) e do músculo oblíquo interno (delineado em amarelo). O objetivo deste protocolo é direcionar a dissecação da parte superior do músculo TVA, mostrada aqui como um triângulo verde sólido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> Figura 2. Visão geral total das junções neuromusculares no músculo TVA. Imagens que mostram exemplos de NMJs do músculo TVA visualizados com coloração imunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína de vesícula sináptica 2 (SV2; verde) e bungarotoxina (BTX; vermelho). As imagens são micrografias fluorescentes em montagem que mostram todo o músculo (A) ou imagens confocal mostrando grupos (B) ou individuais(C)NMJs. Barra de escala = 800 μm(A),70 μm(B),25 μm(C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> Figura 3. Patologia da junção neuromuscular no músculo TVA de um modelo de camundongos de SMA. Micrografias confocal mostrando NMJs do músculo TVA visualizados com coloração imunofluorescente para neurofilamento (NF; verde), proteína vesícula sináptica 2 (SV2; verde) e bungarotoxina (BTX; vermelho) de ambos os controles(Smn2B/+) ou modelo de rato SMA(Smn2B/-). Observe que, embora a morfologia NMJ normal possa ser observada em camundongos de controle, nos músculos TVA de Smn2B/- ratos há evidências de denervação total (ponta de flecha branca), denervação parcial (ponta de flecha roxa) brotando terminal (ponta de flecha azul) e inchaço pré-sináptico (ponta de flecha amarela). As placas finais pós-sinápticas também são menos complexas refletindo um fenótipo aparentemente menos maduro. Barra de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior</a>.

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Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Neste vídeo demonstramos um protocolo de dissecção do músculo transversus abdominis do camundongo e usamos imunofluorescência e microscopia para visualizar junções neuromusculares.

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

11.5K visualizações.  Ottawa Hospital Research Institute. Neste vídeo demonstramos um protocolo de dissecção do músculo transversus abdominis do camundongo e usamos imunofluorescência e microscopia para visualizar junções neuromusculares.

Vídeo: Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Neurociência

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reprodutível mouse esmagamento do nervo ciático e subsequente avaliação de Regeneração por Análise Whole Mount muscular

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Monte todo Dissecção e Imunofluorescência do mouse cóclea Adulto

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

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