Gostaríamos de agradecer a Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi e Kristina Wullimann para assistência técnica excelente. Agradecemos W. Macklin para fornecer Plp GFP-ratos. TM é apoiada pelo Instituto de Estudos Avançados (Technische Universität München), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), pelo Alexander-von-Humboldt-Foundation e pela agência de fomento nacional (&quot;für Bildung und Bundesministerium Forschung&quot; ) no quadro da ERA-NET neurônio &quot;iPSoALS&quot; e &quot;imagem dois fótons&quot;. TM e MB são suportados pelo Centro de Ciência Proteína Integrado (Munique). PM foi apoiado pela Escola de Pós-Graduação da Technische Universität München (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni explante (Figura 1) Cronograma: 15 min. <ol><li> Prepare instrumentos cirúrgicos: 2 pares de fórceps, um par de tesouras, 1 par de tesouras de primavera, um prato de cultura de tecido (10 cm). Previamente borbulhado (mínimo de 15 min) arrefecida (4 ° C) solução de Ringer com 5% CO 2/95% O 2. Preencha 15 cm prato de cultura de tecidos com gelo e cubra-o com placa de metal. Prepare microscópio de dissecção e colocar o prato de 15 cm com gelo sob o escopo de dissecação, de modo a arrefecer o explante durante o esvaziamento. </li><li> Letalmente anestesiar o rato por overdose de isoflurano (ou qualquer outro método aprovado de sacrifício). Pulverizar o rato com etanol a 70% para evitar a contaminação da pele do explante. SC para branqueamento, é usado Plp-GFP ratos, que podem ser atravessados ​​para Thy1-OFP3 ou Thy1-Membow13 para a visualização simultânea do axon. </li><li> Utilizando o par de tesouras grandes, fazer uma incisão na linha média doda pele sobre o esterno e duas incisões paralelas à aresta inferior da caixa torácica. </li><li> Utilizando o par de tesouras grandes, remover a pele, abre a parede abdominal e fazer incisões paralela à caixa torácica todo o caminho de volta para a coluna vertebral. Então dissecar fora os músculos peitorais, fazendo incisões próximas à inserção do músculo no esterno. </li><li> Corte o diafragma aberto logo abaixo da cartilagem xifóide e dissecar fora do diafragma ao longo de suas inserções costais. </li><li> Segurando a caixa torácica pelo processo xifóide com um conjunto de pinças, iniciar o corte das nervuras da coluna vertebral, tão próximo quanto possível das suas inserções. Os cortes de esquerda e direita devem convergir acima do coração em direção ao manúbrio. Tente evitar o corte de grandes vasos sanguíneos (especialmente as veias subclávia). Melhor visibilidade é conseguida levantando com cuidado a preparação ao sustentar o processo xifóide com uma pinça. </li><li> Fazer um corte transversal imediatamente abaixo da manúbrioe transferir o explante no prato de 10 cm com 5% de CO refrigerado 2/95% O 2-borbulhado solução de Ringer. Coloque o recipiente de 10 cm sobre a placa de metal cobrindo a 15 cm de placa de cultura de tecido cheio de gelo. Todas as outras etapas deve ser feita sob o microscópio de dissecação. </li><li> Com uma tesoura pequena mola remover os restos do timo, pleura, diafragma (dentro) e músculos peitorais (fora; Figura 1B-D). </li><li> Para ajustar o explante para o prato de 3,5 cm, dissecar fora todas as costelas que não inserir o esterno. Isto é feito melhor com uma tesoura pequena mola e cortando o tecido entre as costelas (Figura 1E). </li><li> Pin o triangularis Sterni explante nervo-músculo no Sylgard revestido prato de cultura de 3,5 cm tecido utilizando pinos minutien (abreviado para &lt;4 mm; Figura 1G). Dois pinos deve passar por cartilaginosos (branco) partes do esterno. Inserir, pelo menos, dois pinos através das nervuras, tanto do lado esquerdo e direito do thexplante e apontando para as partes mais suaves e cartilaginosos, evitando as costelas sob ou perto do músculo triangularis. Os mais pinos são utilizados, o melhor (que usam tipicamente 8-10). Como você fechar a preparação, certifique-se de que as costelas são um tanto espalhado, a fixação do músculo em uma posição um pouco esticado. </li><li> Opcional: Visualize sítios sinápticos que contêm receptores de acetilcolina através da adição bungarotoxina acoplados a corantes Alexa (concentração de 0,8 ug / ml em 5% CO 2/95% O 2-borbulhado solução de Ringer). Incubar explante fixado em Sylgard prato revestido por 15-20 minutos à temperatura ambiente, em seguida, lavar várias vezes com 5% CO 2/95% O 2-borbulhado solução de Ringer. </li></ol> 2. SCs branquear e Microscopia Time-lapse Opcional (Figura 2) Cronometragem: 30 - 45 min + opcional 1-5 horas, para a lapso de tempo. <ol><li> Transferência de 3,5 cm prato Sylgard revestido de uma sagacidade microscópio confocal equipadoh um laser de argônio (488 nm) e objectivos de água de imersão (4x, 0,13 NA; 20x, e 100x NA 0,5, 1,0 NA ou 60x, 0,9 NA). </li><li> Opcional para lapso de tempo de microscopia: Inserção de 3,5 cm Sylgard revestido prato em anel de aquecimento, instalar o sistema superfusão e sonda de temperatura (Figura 2A). Certifique-se de que nenhum deles tocar o explante, a borda do prato ou do revestimento Sylgard. A amostra é aquecida a 33-35 ° C. Para SC branqueamento sem lapso de tempo, a temperatura ambiente é melhor, como células mostram uma dinâmica menos entre as etapas de branqueamento. </li><li> Com um ar de 4x objetivo observar o padrão de inervação do músculo Sterni triangularis e encontrar banda placa motora triangularis Sterni. Mudar para 20x objetivo mergulhando de cone e começar a olhar para regiões superficiais dentro da banda de placa motora (costelas áreas sobrepostas são bons candidatos). Alterar objetivo de 100x ou 60x objetivo mergulhando-cone para verificar NMJs individuais. Ideal é um JNM que é coberto por vários SCs e está localizado muito superficially (Figura 2B). Se você executar lapso de tempo de imagem após o clareamento, selecionar até três NMJs que estão relativamente próximos entre si para aumentar o rendimento. </li><li> Adquirir uma imagem confocal do NMJ antes de foto-branqueamento SCs individuais (Figura 2B). (Para imagem de resolução completa, por exemplo, em um microscópio Olympus FV1000, usar um 100x, 1,0 e 2,5 NA objectiva zoom, o que resulta em Nyquist de amostragem limitada de ~ 0,1 mM por pixel.) </li><li> &quot;Park&quot; a 488 nm do laser de feixe centralmente sobre o núcleo de um SC usando potência máxima durante 5 segundos (em alternativa, um padrão de pesquisa eficiente de uma pequena região de interesse pode ser utilizado, tal como o &quot;tornado scan&quot; função em um microscópio Olympus; quando usamos um microscópio confocal, o laser é focado para os planos de imagem conjugadas-e, portanto, a 488 nm, com um objectivo de 1,0 NA, &lt;0,5 um de diâmetro). Mude o foco na célula e juiz de branqueamento resultado. Se necessário, repita branqueamento etapa novamente até que os níveis GFP são reduzird para fundo níveis próximos. Adquira uma imagem após o clareamento (Figura 2C). É crítico para certificar-se que a região é branqueada fora de qualquer sobreposição entre as duas células - se há uma sobreposição, branqueamento em uma segunda célula serão óbvias. </li><li> Repetir o passo anterior até que todas menos uma SC são branqueadas (Figura 2D-E). A última &quot;crus&quot; SC é adequado para microscopia confocal lapso de tempo. Reconstruir células individuais, por subtracção de imagens, por exemplo, utilizando software Photoshop, para delinear a morfologia única e SC território (Figura 2F). Esteja ciente de que subtraindo dois magos acrescenta ruído (por exemplo, importando-os no consecutivos &quot;camadas&quot; no Photoshop e, em seguida, definir o canal de cima para &quot;diferença&quot; no menu drop-down no topo da guia canais). Isso pode ser contornado usando o &quot;despeckle&quot; função nos canais antes de subtração e corte fora qualquer fundo que, obviamente, não se origina a partir dacélula branqueada. Para optimizar o contraste, pode ser necessário ajustar o brilho dos dois canais na &quot;níveis&quot; janela. A imagem resultante da célula branqueada é sobreposta na imagem original de uma sinapse, pseudo-colorida num tom único e tornada transparente para colorir o território da célula branqueada na imagem original (de fazer isto para todos branqueada e a última , células não branqueado a imagem mostrada na Figura 2F resultados). </li><li> Opcional: Iniciar microscopia confocal lapso de tempo após o clareamento todos, mas uma SCs. Pegue uma imagem em intervalos fixos (por exemplo, a cada 5 minutos a 10). Uso como potência de laser pequeno quanto possível. Até 3 NMJs podem ser visualizados na mesma sessão. </li><li> Faça um mapa dos NMJs tempo decorrido, tendo uma imagem em 100 vezes sem zoom, em seguida, imagens da região usando 20x e objetivos 4x (Figura 2G-I). Este &quot;mapa&quot; é necessário para encontrar NMJs seguintes imunohistoquímica de um músculo fixa. </li><li> Para a imagemprocessamento, converter imagens individuais em projeções de intensidade máxima e salvar em formato TIFF. Misture todos os z-projetadas tempo de pontos em uma pilha e alinhar em xy, por exemplo, usando o plugin &quot;stackreg&quot; 10 em Fiji (um pacote com base no software livre ImageJ; Institutos Nacionais de Saúde). </li></ol> 3. Fixação e imuno-histoquímica (Figura 3) Timing: Overnight. <ol><li> Transferir o explante num tubo de reacção de 50 ml contendo, pelo menos, 15 ml de 4% PFA removendo cuidadosamente os pinos. Pós-fixar a parede torácica anterior, contendo o músculo Sterni triangularis durante 1 hora em gelo. Enxaguar tecido fixado com glicina 0,1 M em PBS (para extinguir fixador residual e, consequentemente, reduzir o fundo) durante pelo menos 10 min. As amostras podem ser armazenadas a este ponto e processada mais tarde. </li><li> Transferir para um explante fixo de 10 cm de placa de cultura de tecido revestido Sylgard cheio com 0,01 M de PBS. Cortar uma forma trapezoidal com uma side paralelo para o esterno e o outro através das transições osso-cartilagem - este contém o músculo triangularis na sua superfície. Remover costelas inferiores com uma horizontal (ou seja, trans-esternal) cortado, de modo que a extremidade caudal do músculo triangularis pode ser acessado livremente (Figura 3A-D). </li><li> Inserir uma agulha hipodérmica como um pino para a parte superior do trapézio (Figura 3E). Use uma agulha hipodérmica ligada a uma seringa de 1 ml e uma pinça para remover o músculo triangularis na superfície suavemente agarrar um canto caudal do músculo e usando a agulha como um micro-escalpelo. Certifique-se de que os cortes são feitos paralelos ao plano da parede torácica. Uma vez que a parte caudal do músculo é libertado, se inserir uma nova agulha hipodérmica como um pino inferior ao músculo através da parede torácica - isto imobiliza a preparação e permite exercer um puxão suave sobre o músculo usando fórceps (Figura 3F). Como você está cortando tiss conjuntivoinserções ue, &quot;casca&quot; de distância do músculo do tórax. Corte anexo caudal última com uma tesoura de mola. Remover restos de navios de gordura e sangue, usando uma pinça. Tenha cuidado para não rasgar os nervos Nota:. Use diferentes conjuntos de ferramentas e pratos para trabalhar com tecido vivo e fixo. </li><li> Iniciar imunohistoquímica (utilizando um protocolo normalizado), transferindo as amostras de tecido em solução de bloqueio durante 1 hora num agitador à temperatura ambiente. Menor volume possível de coloração é de 200 ul usando uma placa de 96 poços. </li><li> Aplicar o anticorpo primário diluído em solução de bloqueio, 200 ul por poço, durante a noite a 4 ° C num agitador. </li><li> Lavar com PBS 0,01 M, três vezes, durante 10 min. </li><li> Aplicar o anticorpo secundário adequado durante 1-2 horas à temperatura ambiente, diluiu-se em solução de bloqueio. </li><li> Lavar com PBS 0,01 M, três vezes, durante 10 min. </li><li> Montar em anti-desbotamento meio (por exemplo Vectashield) e lamela. </li><li> Colocar a lâmina na placa de metal magnético, ímã lugar no topoda amostra para achatar por algumas horas ou durante a noite a 4 ° C. Selo com unha polonês. </li></ol>

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	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método aqui apresentado SC branqueamento é simples, rápido e versátil: (i) permite revelar a morfologia única e SC dinâmica por meio de microscopia confocal baseado num único transgene - o que é uma vantagem significativa quando se combina a abordagem por exemplo, com modelos de doenças que necessitam de alelos adicionais . (Ii) O método é rápido, a partir de dissecação para a fixação pode ser realizada em meio dia. (Iii) O número de aplicações é vasto, uma vez que pode ser combinado com o...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Empresa (exemplo) </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Solução de etanol a 70% (vol / vol) </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> em frasco de spray </td></tr><tr><td> isoflurano </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> qualquer outro anestésico aprovado pode ser utilizada para a anestesia letal </td></tr><tr><td> ratinhos transgénicos (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> de ser obtida a partir de fontes citadas </td></tr><tr><td> microscópio de dissecção com iluminação de luz fria </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> equipado com Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> fórceps #2 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> fórceps # 5 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> tesoura, médicos grande </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> tesoura, mola angular pequena </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> na linha de aquecedor </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> aquecimento anel para 3,5 centímetros pratos </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> de dois canais do sistema de controlo de temperatura </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> sistema de bomba de superfusão </td><td></td><td></td><td> custom-built </td></tr><tr><td> 15 cm de diâmetro prato de cultura de tecidos </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> cheio de gelo e coberta por uma placa de metal </td></tr><tr><td> 10 centímetros, prato de cultura de tecidos </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> com solução de Ringer oxigenado do </td></tr><tr><td> 3,5 centímetros, prato de cultura de tecidos </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> preenchido com polímero Sylgard </td></tr><tr><td> Sylgard polímero </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone </td><td></td></tr><tr><td> microscópio confocal </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td><td> com laser de árgon </td></tr><tr><td> De 50 ml, tubo de reacção </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% PFA em PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> cânula 0,5 mm x 25 milímetros </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> seringa de 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> anticorpo sinaptofisina </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> coelho </td></tr><tr><td> anticorpo secundário </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> Placa de 24 poços </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina 0,1 M em PBS </td><td> Roth </td><td> 3790,1 </td><td></td></tr><tr><td> lamínulas </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> lâminas </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector laboratórios </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> pinos minutien × 10 </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26002-20 </td><td> reduzido para &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α bungarotoxina acoplado a Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solução de Bloqueio </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% de Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> O soro de cabra normal a 10% </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% de albumina sérica bovina </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Sineiro borbulhada com 95% de O2 / 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM de NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM de KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM de CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM de MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM de glicose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes específicos e equipamentos. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Sequencial de foto-branqueamento fornece uma maneira não-invasiva para rotular SCs individuais no NMJ. O NMJ é a maior sinapse do sistema nervoso de mamíferos e serviu como guia modelo para estudar a estrutura e função sináptica. No rato NMJs terminais do motor axônio formar locais pretzel, como contato com as fibras musculares. O axônio motor e seu terminal são revestidos por SCs. Ao longo das últimas décadas, vários ratinhos transgénicos que foram gerados para visualizar os neurónios motores e SCS, por exemplo Thy1-XFP 1 e Plp-GFP ratos 2, respectivamente. Junto axônios motores, myelinating SCs axonais são dispostos em não sobrepostos entrenós, separados por nós de Ranvier, para permitir a propagação saltatória potencial de ação. Em contraste, a SCS terminais na sinapse são especializados células gliais, que monitoram e promover a neurotransmissão, digerir os detritos e os axônios guia de regeneração. NMJs estão bem cobertos em até meia dúzia de não-mielinating SCs terminais - estes, no entanto, não podem ser resolvidas individualmente por microscopia de luz, uma vez que estão em contacto directo membrana 3. Diversas abordagens existem para visualizar individualmente SCs terminais. Nenhum destes são impecáveis, embora. Por exemplo, o corante de enchimento, em que as células individuais são empalado com um microeléctrodo de corante-cheia, requer a destruição de uma célula marcada antes do enchimento de um segundo. Esta não é compatível com subseqüentes lapso de tempo gravações 3. Multi-espectral &quot;Brainbow&quot; rotulagem de SCs foi conseguido usando a expressão combinatória de proteínas fluorescentes 4. No entanto, esta técnica requer que combina diversos transgenes e está limitado por o padrão de expressão dos promotores utilizados. No futuro, a expressão de &quot;photo-comutável&quot; proteínas em SC pode ser ainda mais 5 alternativa. Aqui apresenta-se foto-branqueamento sequencial, em que as células individuais são branqueados, e sua imagem obtida por subtracção. Acreditamosque esta abordagem - devido à sua facilidade e versatilidade - representa uma adição duradoura para a paleta neurocientista da tecnologia, especialmente no que pode ser utilizado in vivo e transferido para outros tipos de células, os locais anatómicos e espécies 6. No protocolo a seguir, detalhes que a aplicação de branqueamento e seqüencial subseqüente microscopia confocal lapso de tempo para SCs terminais em explantes musculares triangularis Sterni. Esta fina, superficial e facilmente dissecados preparação nervo-músculo 7,8 tem se mostrado útil para estudos de NMJ desenvolvimento, fisiologia e patologia 9. Finalmente, vamos explicar como o músculo Sterni triangularis está preparado para executar após a fixação correlacionada de alta resolução de imagem confocal, imunohistoquímica ou exames ultra-estruturais.

Um exemplo de um explante Sterni triangularis pronto para o prato de imagem é mostrado na Figura 1G. Este explante é particularmente adequada para a imagiologia ex vivo NMJs como o músculo triangularis consiste apenas de algumas camadas de fibras musculares. Isto permite a obtenção de imagens de alta resolução a partir de explantes derivados de linhas de ratinhos transgénicos que realce ou SCs (PLP-GFP 2) e / ou (axónios Thy1-XFP 1). Factores cr?...

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualizando as células individuais em tecidos densamente compactados, tais como as células de Schwann terminais (SCs) em junções neuromusculares (NMJs), é um desafio. &quot;Sequential foto-branqueamento&quot; permite delinear SCs terminais individuais, por exemplo, no explante triangularis músculo Sterni, uma preparação conveniente nervo-músculo, onde sequencial de branqueamento podem ser combinados com o lapso de tempo de imagem e<em&gt; Post-hoc</em&gt; Imunomarcações.

Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

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JoVE Journal

Neuroscience

10.5K visualizações.  Technische Universität München. Visualizando as células individuais em tecidos densamente compactados, tais como as células de Schwann terminais (SCs) em junções neuromusculares (NMJs), é um desafio. "Sequential foto-branqueamento" permite delinear SCs terminais individuais, por exemplo, no explante triangularis músculo Sterni, uma preparação conveniente nervo-músculo, onde sequencial de branqueamento podem ser combinados com o lapso de tempo de imagem e Post-hoc Imunom...

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Neurociência

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissecção do Músculo Transversus Abdominis para Análise de Junção Neuromuscular de Montagem Integral

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Detecção de<em&gt; In Situ</em&gt; Complexos proteína-proteína no<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Em Gene Vivo Transferência de células de Schwann no nervo ciático de roedores por Eletroporação

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Medir a funcionalidade da junção Neuromuscular

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissecção e Imunohistoquímica da Perna Adulta Drosophila para detectar alterações na junção neuromuscular para um neurônio motor identificado

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registro de Transintes de Cálcio na Junção Neuromuscular do Rato com Alta Resolução Temporal utilizando Microscopia Confocal

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

Visualizando as Características Morfológicas da Junção Neuromuscular no Músculo Gastrocnemius De Rato Medial

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...