Este protocolo descreve um método simples e rápido para medir a função mitocondrial tumoral. O protocolo é amplamente aplicável à oncologia translacional clínica, e ajudará a melhorar a interpretação diagnóstica e mecanicista do papel das mitocôndrias no início e progressão do câncer. A principal vantagem dessa técnica é a aplicação da homogeneização do tecido para simplificar a preparação e maximizar o rendimento das mitocôndrias, ao mesmo tempo em que mitiga as limitações da difusão.
Esta técnica oferece aplicações potenciais em configurações clínicas e diagnósticas com uma avaliação quantitativa da função mitocondrial tumoral utilizando tecido tumoral recém-biópsia ou excisado. Comece colocando um homogeneizador de vidro contendo um mililitro de meio de respiração mitocondrial, ou MiR05, em um pilão de vidro bem ajustado em gelo molhado. Coloque o tecido em um mililitro de solução de preservação da biópsia, ou BIOPS, em uma placa de Petri gelada.
Corte o tumor em pequenos pedaços de aproximadamente 5 a 10 miligramas cada, e coloque os pedaços restantes do tumor de volta em 10 mililitros de BIOPS mantidos no gelo. Depois de borrar cuidadosamente as seções teciduais em um papel filtro, coloque-as em um pequeno barco de pesagem de plástico e registre o peso molhado inicial. Coloque os pedaços nãousados de volta no tubo cônico de 10 mililitros de BIOPS para preservação contínua.
Submergir as seções teciduais em um homogeneizador gelado contendo MiR05 e registrar o peso restante no barco de pesagem. Usando um pilão de vidro com uma faixa de liberação de 0,09 a 0,16 milímetros, interrompa suavemente o tecido tumoral completando cinco a sete derrames para baixo e para cima. Para cada traçado, gire o pilão em um movimento no sentido horário/anti-horário três vezes enquanto empurra o pilão para baixo, e três vezes adicionais enquanto puxa o pilão de volta para cima.
Deixe o tecido se acomodar na parte inferior do homogeneizador entre os traços, mas evite trazer o pilão totalmente acima do volume do fluido para evitar espuma. Despeje o homogeneizar em um tubo cônico de 15 mililitros e coloque-o no gelo. Pipeta de um a três mililitros de MiR05 fresco sobre o pilão e no homogeneizador para lavar qualquer tecido restante homogeneizado.
Despeje a lavagem miR05 no tubo cônico contendo o homogeneizar. Repita esta etapa duas a três vezes para garantir a transferência completa do homogeneado. Para calcular com precisão a concentração homogeneizada do tecido, inspecione cuidadosamente o homogeneizador e o homogeneizado para o material não homogeneizado restante, o que inclui tecido conjuntivo.
Para remover o material não homogeneizado do homogeneizador que não pode ser alcançado com pinças, depois de adicionar MiR05 ao homogeneizador, aspire o volume, incluindo o tecido, com uma pipeta e mova o conteúdo para uma placa de Petri. Remova o material não homogeneizado instalado em pedaços grandes na parte inferior do tubo cônico do homogeneizado aspirando-os com uma pipeta e coloque-os na tampa do tubo cônico. Remova o tecido da placa de Petri ou da tampa cônica do tubo com pinças, e borre-o no papel do filtro.
Adicione o homogeneado restante da tampa cônica do tubo de volta ao tubo cônico. Tampe o tubo, depois inverta para misturar. Reinspecionar os homogeneizadores e homogeneizar para qualquer material não homogeneizado adicional, e repetir os passos para remover material não homogeneizado, se necessário.
Pese e registe a massa do material não homogeneizado recuperado do homogeneizador. Inspecione a preparação homogeneizada para qualquer tecido grosseiramente intacto transferido, e remova as peças não homogeneizadas e pese conforme necessário. Subtrair o peso tecidual recuperado do barco de pesagem, homogeneizador e homogeneizar do peso molhado inicial para calcular o peso amostral final.
Utilizando o peso amostral final, adicione MiR05 adicional para trazer homogeneizar à concentração desejada. Uma vez que a homogeneidade seja ponderada e preparada, proceda ao ensaio o mais rápido possível. Mantenha a amostra armazenada em gelo molhado até que seja transferida para o instrumento.
Uma vez calibrado o instrumento e a amostra é preparada, remova as rolhas com um movimento de torção e aspire o MiR05 das câmaras, evitando a membrana exposta dentro da câmara. Misture bem a homogeneizar e adicione 2,25 mililitros do homogeneizar à câmara. Suponha que um homogeneizado esteja sendo adicionado a várias câmaras, pipeta um mililitro do homogeneizado de cada vez em cada câmara enquanto mistura o homogeneizado para garantir a distribuição igualitária do tecido.
Clique em F4 para nomear e datam do evento e clique em Ok. Encha uma seringa de 50 mililitros com oxigênio de um tanque de oxigênio com um regulador e tubos de gás usando uma agulha de calibre 18. Injete o oxigênio diretamente nas câmaras para hiperoxigená-los a aproximadamente 500 oxigênio micromolar.
Insira as rolhas e espere fechar até que o oxigênio atinja aproximadamente 480 micromolar. Com um movimento de torção, feche lentamente a câmara e deixe a respiração equilibrar por aproximadamente 15 a 20 minutos. Encha o capilar central da rolha com MiR05, se necessário.
Use microsiinges dedicados para injetar substratos, desacopladores e inibidores em câmaras totalmente fechadas para nomear e marcar os eventos para cada câmara em tempo real. Selecione F6 para ajustar a concentração de oxigênio e as escalas negativas de inclinação de oxigênio conforme necessário. Após cada injeção, lave a seringa três vezes em água para compostos solúveis em água e 70% etanol para compostos dissolvidos com etanol.
Adicione cinco microliters de 0,8-molar malate e prossiga imediatamente para a próxima injeção. Lave a seringa de injeção três vezes na água. Adicione imediatamente cinco microlitadores de piruvato 1-molar, e espere a respiração estabilizar.
Depois de lavar a seringa, adicione 10 microliters de 0,5-molar ADP e espere que a resposta ADP se estabilize. Lave a seringa e adicione cinco microlitadores de glutamato 2-molar e espere que a respiração se estabilize. Lave a seringa, adicione cinco microlitadores de citocromomo-C 4 mililitro e espere a respiração estabilizar.
Depois de lavar a seringa, adicione 20 microlitadores de 1-molar succinato e espere a respiração estabilizar. Titule incrementos de 0,5 a 1 microliter de 1 mililitro FCCP e espere que a respiração se estabilize após cada injeção. Continue até que não haja aumento adicional na respiração.
Lave a seringa de injeção três vezes em 70% de etanol. Adicione dois microliters de rotenona de 150 micromolares e espere a respiração estabilizar. Adicione outro microliter de rotenona para garantir que não haja mais inibição.
Se houver uma diminuição da respiração, continue com injeções adicionais até que não haja diminuição na respiração, depois lave a seringa de injeção três vezes em 70% de etanol. Adicione dois microliters de 125 micromolars antimicina A e espere a respiração estabilizar. Adicione outro microliter de antimicina A para garantir que não haja mais inibição.
Se houver diminuição da respiração, continue com injeções adicionais até que não haja diminuição na respiração. Lave a seringa três vezes com 70% de etanol. Verifique a concentração de oxigênio da câmara.
Se a concentração estiver abaixo de 125-micromolar, reoxigenar ao ar do quarto, ou levemente hiperoxicante para garantir que o oxigênio não limite o fluxo respiratório. Adicione cinco microliters de 0,8-molar ascorbate. Lave a seringa três vezes em 70% de etanol.
Adicione imediatamente 10 microlitres de 0,2-molar TMPD, e aguarde um aumento na respiração. Depois de lavar a seringa com etanol, adicione 25 microliters de 4-molar azida de sódio imediatamente quando o fluxo respiratório de planaltos de ascorbate TMPD. Finale clicando em Arquivo, Salvar e desconectar.
Observou-se que 40 miligramas por mililitro de homogeneizar o tecido resultaram em esgotamento rápido de oxigênio. O consumo de oxigênio desacelerou substancialmente com 30 e 20 miligramas por mililitro de homogeneizado tecidual, mas ainda diminuiu rapidamente em pouco tempo na ausência de substratos ou ADP. A concentração de 10 miligramas por mililitro de homogeneidade tecidual resultou na taxa ideal de consumo de oxigênio.
Um protocolo SUIT foi utilizado para avaliar a fosforilação oxidativa ligada ao NADH e ao succinato e à transferência de elétrons, bem como a atividade do Complexo IV. A liberação do citocromo C foi avaliada na presença de piruvato e malato, ou succinato e rotenona, ambos revelaram que a preparação homogene de homogeneidade não danificou as mitocôndrias. Verificou-se também que a fosforilação oxidativa ligada ao NADH era insignificante nos tumores EO771.
A titulação do FCCP para conduzir o fluxo máximo de elétrons revelou que em tumores EO771, a fosforilação, em vez de oxidação, limitava-se à respiração. Os perfis respiratórios homogeneizados do tumor foram semelhantes aos das células EO771 não implantadas, com exceção da diminuição da transferência máxima de elétrons suportada por substratos ligados a N e S no tumor. A cinética respiratória do succinato foi ainda avaliada por titulações stepwise de ADP subsaturante até que a taxa máxima fosse alcançada.
A concentração semi-máxima de ADP na presença de succinato e rotenona foi de 37,5 micromolar, enquanto a taxa máxima foi de aproximadamente 10,5 picomoles por segundo, por miligrama. Os instrumentos montados no cuidado de rotina, bem como o manuseio de tecidos, são de fundamental importância para o sucesso desses experimentos. Após esses procedimentos, outras abordagens específicas de massa ou marcadores para normalização da taxa podem ser aplicadas com base na questão de interesse.
As medidas comuns incluem quantificação total de proteínas e atividade enzimática de sinthase citrato, mas variam de acordo com o sistema modelo, design estatístico e questão de pesquisa.
