Este estudo é totalmente suportado pela divisão de pesquisa Intramural do Instituto Nacional de enfermagem pesquisas de NIH, Bethesda, Maryland.

O estudo atual (NCT00852111) foi aprovado por institucional Review Board (IRB) do National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Os participantes inscritos no presente estudo foram homens euthymic, 18 anos de idade ou mais velhos, que foram diagnosticados com câncer de próstata não-metastático, com ou sem prévia prostatectomia e estava programado para receber a terapia de radiação de feixe externo (RT). Potenciais participantes foram excluídos se eles tinham uma doença progressiva que pode causar fadiga significativa, doença psiquiátrica dentro dos últimos cinco anos, tive hipotireoidismo não corrigido ou anemia, ou tinha uma segunda malignidade. Indivíduos que usavam sedativos, esteroides ou agentes anti-inflamatórios não-esteroides também foram excluídos. Amostras de sangue de controle saudáveis foram obtidas na medicina NIH departamento de transfusão de doadores saudáveis sob um protocolo aprovado IRB (NCT00001846). Todos os participantes são recrutados no Magnuson Clinical Research Center no NIH. Escrito assinados informado consentimentos foram obtidos antes da participação do estudo.
1. preparação de medição de função mitocondrial (1º dia do experimento)
<ol><li>Hidratar o cartucho do Sensor (ver Tabela de materiais; aproximada duração: 5 min).<ol>
<li>Retire o cartucho do Sensor da embalagem. Adicionar a solução de Calibrant 200 μL em cada poço da placa de utilidade e, em seguida, encha cada fosso com solução de Calibrant 400 μL.</li>
		<li>Placa de Sensor retorno para a placa de utilitário, que agora tem a solução de Calibrant nele. Hidrate o cartucho numa incubadora não-CO2 37 ° C durante a noite. Nota: O Sensor cartucho precisa ser hidratado por um mínimo de 4 h e máximo de 72 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação da amostra clínico (2º dia do experimento)
<ol><li>Fadiga de medida usando o item de 13 funcional avaliação de doença terapêutica crónica - fadiga (FACIT-F)2,23,24 na linha de base (antes da iniciação de RT), ponto médio e conclusão de RT e 1 ano pós-RT.<ol>
<li>Use um 0 - 4 escala para cada resposta a um item, onde 0 representa "nada" e um 4 indica que o entrevistado refere-se à instrução correspondente "muito obrigado". Escores totais devem variar de 16-53, com menor pontuação refletindo fadiga de alta intensidade.</li>
		<li>Defina fadiga como uma contagem de FACIT-F inferior a 43, com uma pontuação de FACIT-F de ≥43, indicando ausência de ou de fadiga não clinicamente significativo2. Nota: O placar de 43 melhores FACIT-F divide escores de fadiga de pacientes com câncer e a população em geral2.</li>
		<li>Incluem os seguintes 13 itens da escala de fadiga FACIT: 1) sinto-me cansado; 2) Sinto-me fraco tudo acabado; 3) eu me sinto apático ("desbotada"); 4) Sinto-me cansado; 5) eu tenho dificuldade para iniciar as coisas, porque estou cansada; 6) eu tenho dificuldade para terminar as coisas, porque estou cansada; 7) tenho energia; 8) eu sou capaz de fazer minhas atividades habituais; 9) preciso dormir durante o dia; 10) eu estou cansado demais para comer; 11) preciso de ajuda para fazer minhas atividades habituais; 12) estou frustrado por estar muito cansado para fazer as coisas que quero fazer; e 13) tenho que limitar minha atividade social, porque estou cansado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolar o PBMC de amostras de sangue coletadas recentemente (aproximado de duração: 1h).<ol>
<li>Coletar 8 mL de sangue em um tubo de preparação de células mononucleares (ver Tabela de materiais). Nota: Amostras de sangue devem ser processadas até 2 horas após a coleta. A qualidade de PBMC pode ser comprometida se as amostras de sangue são processadas mais de 2h após a coleta da amostra.</li>
		<li>Centrifugar a 1.750 x g, durante 30 min à temperatura ambiente (18-25 ° C). Transferi a camada nublada para um tubo cônico de 15 mL. Adicionar até 15 mL de PBS e inverter 5 vezes.</li>
		<li>Centrifugar a 300 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Retire cuidadosamente e desprezar o sobrenadante sem perturbador da pelota. Ressuspender o sedimento com a adição de 10 mL de PBS e inverter 5 vezes.</li>
		<li>Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Descartar o líquido sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS. Transferi os PBMCs para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 610 x g durante 10 minutos. Cuidadosamente Retire o sobrenadante e ressuspender em RPMI-1640 completo (RPMI-1640, suplementado com 10% FBS, 10mm penicilina/estreptomicina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revestimento de placas de célula para células não-aderente (aproximado de duração: 30 min).<ol>
<li>Preparar a solução adesiva de células e tecidos (ver Tabela de materiais) diluindo a solução estoque em bicarbonato de sódio de 0,1 M pH 8,0. A solução deve ser em 3,5 μg/cm2 de área de superfície. Nota: Esta solução contém proteínas de polifenólicos extraídas do marinho mexilhão, Mytilus edulis. Estas proteínas são componentes-chave da colagem secretada pelo mexilhão para ancorar-se às superfícies. Achamos que a célula-Tak funciona melhor com PBMC.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de solução diluída adesiva a cada poço e incubar durante pelo menos 20 min em temperatura ambiente. Lavar três vezes com água Desionizada e ar seco.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mitocondrial função medição
<ol><li>Preparação de meios de ensaio (aproximado de duração: 10 min). Nota: Mídia de ensaio deve ser preparadas no dia do experimento.<ol>
<li>Adicione L-glutamina, piruvato e glicose à base de mídia (mesmos componentes como modificado águia de Dulbecco médio (DMEM), mas sem bicarbonato de sódio, glicose, glutamina ou piruvato de sódio) para fazer o ensaio de mídia. Aquecer a mídia a 37 ° C, então ajuste o pH para 7,4. Nota: As concentrações de glicose, piruvato e L-glutamina são geralmente as mesmas concentrações em meios de crescimento normal, mas podem ser ajustadas baseadas no ensaio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se para o teste de estresse de Mito PBMCs (aproximado de duração: 2h).<ol>
<li>Placa suficiente PBMCs do passo 2 para cada poço para alcançar a confluência de 80-90%. Em nossa experiência, de 1,5 x 105 células/poço produziu os resultados mais consistentes. Nota: Poços A e H são poços de fundo e devem conter apenas meios de ensaio com nenhuma célula. Em poços B a G, recomendamos chapeamento poços de pelo menos 3-6 por amostra do paciente para dar conta valores atípicos.</li>
		<li>Gire os pratos para baixo a 200 x g por 2 min permitir que as células aderir ao fundo dos poços. Lave as células uma vez com mídia de ensaio. Nesta etapa remove soro e bicarbonato de sódio a mídia de crescimento. Nota: Na nossa experiência, a etapa de lavagem remove tipicamente 20-30% das células.</li>
		<li>Adicione mídia de ensaio 180 µ l em cada poço, incluindo poços de fundo A e H. Incubar em uma incubadora de 37 ° C não-CO2 por 45-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Executando o teste de Stress do Mito<ol>
<li>Reconstitua drogas no Mito Stress Kit com mídia de ensaio da seguinte forma:<ol>
<li>Oligomicina: Adicione mídia de ensaio μL 252 dentro do frasco para gerar uma solução stock de 50 μM.</li>
			<li>FCCP: Adicione 288 μL de mídia de ensaio dentro do frasco para gerar uma solução stock de 50 μM.</li>
			<li>Antimycin A / rotenona: Adicionar 216 μL de mídia de ensaio dentro do frasco para gerar uma solução stock de 25 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vórtice reconstituído drogas durante aproximadamente 1 minuto. Dilua em soluções de trabalho. Nota: As concentrações das soluções de trabalho devem ser tituladas e pre-determinadas antes do experimento, dependendo do tipo de célula. Por PBMC, encontramos que 1 μM de oligomicina, 1 μM Compararia e 0,5 μM antimycin A / o melhor trabalho de rotenona.</li>
		<li>Pipete as drogas para cada porta no cartucho sensor sequencialmente:<ol>
<li>R: Porto pipeta 20 μL de 10 μM oligomicina, para uma concentração final de 1 μM em cada poço.</li>
			<li>Porta b: pipeta 22 μL de 10 μM Compararia, para uma concentração final de 1 μM em cada poço.</li>
			<li>C Porto: Pipeta 25 μL de 5 μM antimycin A / rotenona para uma concentração final em cada poço de 0,5 μM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione "teste de estresse do Mito" um instrumento de fluxo extracelular. Siga o prompt de instrumento e insira o cartucho de sensor. O aparelho executará automaticamente a calibração do sensor. Insira a placa de células após a calibração do sensor e o instrumento vão terminar o resto do ensaio. Dinâmica de oxigênio é medida a 530 nm (excitação) / 650nm (emissão), e a concentração de prótons é medida a 470 nm (excitação) / 530 nm (emissão).</li>
</ol>4. normalização de dados função mitocondrial
<ol><li>Preparar a solução de ensaio de proliferação de células (aproximado de duração: 5 min).<ol>
<li>Adicionar 48 mancha de ácido nucleico μL (500 x) e supressor de fundo 240 μL a 11,7 mL de PBS (2x). A mancha de ácido nucleico é um corante de ligação a DNA a célula-permeant, e o supressor de fundo é um corante de mascaramento que bloqueia as células mortas ou células com integridade comprometida da membrana celular de ser manchado. A combinação entre o corante de ligação a DNA e o supressor de fundo garante que as células só ao vivo estão manchadas.</li>
		<li>Adicione igual volume de solução de trabalho (180 μL) de 2x diretamente no meio de cada poço após o teste de estresse do Mito foi concluída.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar as células na presença de solução de ensaio de proliferação de célula em uma incubadora de 37 ° C por 45-60 min Quantify o número de células vivas (fluorescente) em um leitor de placa no 508 nm (excitação) / 527 nm (emissão) e normalizar dados OCR (aproximado de duração: 10 min) . Nota: além da números células vivas, os usuários podem também optar normalizar seus dados com o número total de células, a quantidade de ácido nucleico, as concentrações de proteína, etc.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).</li><li>Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+determination+of+cell+number+using+the+CyQUANT&#174;+cell+proliferation+assay.">Sensitive determination of cell number using the CyQUANT&#174; cell proliferation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).</li><li>Hartman, M. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+vascular+function+in+type+2+diabetes+mellitus.">Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus.</a> Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Fadiga em pacientes com câncer é uma condição debilitante que não está bem definida ou caracterizada1. Diagnóstico da fadiga depende inteiramente subjetivo relatórios e não há nenhum padrão atual de diagnóstico ou tratamento para essa condição, em grande parte devido à falta de entendimento em sua Patobiológico2. Dos propostos mecanismos subjacentes fadiga em pacientes com câncer, deficiência na função mitocondrial é uma das vias mais terapeuticamente t...

A fadiga é uma condição prevalente e angustiante que tem um impacto negativo sobre a qualidade de vida dos pacientes de câncer1. Até esta data, fadiga de câncer permanece mal definida e depende apenas de comunicação subjetiva pelos pacientes2. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar um teste de laboratório de diagnóstico facilmente adaptável para caracterizar objectivamente fadiga no ambiente clínico3,4.
Vários mecanismos subjacentes, incluindo disfunção da mitocôndria, têm sido propostos para causar fadiga5. As mitocôndrias são as organelas de potência, fornecendo a 95% das necessidades de energia celular através da fosforilação oxidativa e desempenham um papel importante na sinalização de cálcio, apoptose, sinalização imune e regulamento de outros de eventos de sinalização intracelular6 . Da mesma forma, prejudicada bioenergética mitocondrial e defeitos na produção de energia podem contribuir para fadiga. Apoiam esta hipótese, estudos anteriores observaram mutações no DNA mitocondrial em pacientes com síndrome de fadiga crônica7. Enquanto isso ainda não está claro se a origem fisiopatológico da fadiga encontra-se dentro do sistema nervoso central ou periféricos tecidos, como músculos esqueléticos8,9, não existe actualmente nenhum método directo para avaliar com precisão disfunção mitocondrial relacionada à fadiga em células vivas, desoxigenadas.
Usando células mononucleares de sangue periférico (PBMC) para estudar a função mitocondrial oferece várias vantagens. Primeiro, PBMCs estão prontamente disponíveis na prática clínica usando flebotomia padrão e podem ser isolados rapidamente utilizando técnicas básicas de laboratório. Em segundo lugar, coleta de sangue é menos invasiva do que a coleta de outros tecidos como uma biópsia muscular. Assim, amostras de sangue podem ser coletadas do paciente mesmo várias vezes ao longo do tempo, o que facilita a avaliação longitudinal dos efeitos do tratamento. Curiosamente, função mitocondrial em PBMCs aparenta ser bem correlacionados com status mitocondrial de rim em um modelo animal de10. Além disso, mitocôndrias de células imunes tem sido usadas como um proxy para detecção de alterações sistêmicas sob condições de diferentes doenças11,12. Mitocôndrias nas células do sistema imunológico de circulação são particularmente sensíveis a mudanças nas funções imunes e imune de sinalização moléculas tais como citocinas13,14,15. Por exemplo, tem sido observado que PBMC de pacientes com doenças inflamatórias reumáticas agudas apresentam alta de base de consumo de oxigênio14. Em contraste, o consumo de oxigênio foi reduzido em PBMCs isoladas de pacientes com condições inflamatórias sistémicas, incluindo sepse16. Sob condições inflamatórias, radicais livres produzidos por mitocôndrias disfuncionais pode contribuir mais elevado estresse oxidativo e inflamação prolongada17. O papel central da mitocôndria na produção de energia, bem como em estresse oxidativo sugere o potencial utilitário de usando a função mitocondrial como um proxy para o estudo de fadiga em pacientes de câncer 13.
Estudos anteriores, examinando a função mitocondrial utilizaram técnicas bioquímicas, medição do potencial de membrana mitocondrial ou isolamento de populações de células específicas que não podem ser facilmente adaptável ao ambiente clínico5, 14,18. Nos últimos anos, o desenvolvimento de ensaios de fluxo extracelular permitiu aos pesquisadores facilmente e com precisão, examinar as mudanças na taxa de consumo de oxigênio (OCR) em resposta às injeções automatizadas de inibidores respiratória19,20 , 21 , 22. no entanto, a maioria desses estudos é projetada para tipos específicos de células e o grande formato de alto rendimento pode não ser aplicável em um ambiente clínico. Este manuscrito, descrevemos um protocolo otimizado para examinar a função mitocondrial para uso clínico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:331px;">CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:165px;">362761</td>
			<td style="width:257px;">For isolating PBMCs following phlebotomy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>For making growth media for PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell-Tak</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354240</td>
			<td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XF Calibrant Solution</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103059-000</td>
			<td>For hydrating cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103022-100</td>
			<td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">XF base media</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103335-100</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-037-CI</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium pyruvate solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-glutamine solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td>For making XF assay media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103010-100</td>
			<td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C35011</td>
			<td>For quantification of live cells and data normalization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Seahorse XFp Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S7802AEA</td>
			<td>For measuring mitochondrial function in live cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BTCYT5PV</td>
			<td>For quantification of live cells and data normalization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

A fadiga é um comum e debilitante condição que afeta a maioria dos pacientes com câncer. Até à data, restos de fadiga mal caracterizados com nenhum diagnóstico teste para medir objetivamente a gravidade dessa condição. Aqui nós descrevemos um método otimizado para avaliar a função mitocondrial de PBMC coletadas de pacientes com câncer fatigados. Usando um sistema compacto fluxo extracelular e injeção sequencial de inibidores respiratórias, examinamos estado funcional mitocondrial de PBMC medindo basal respiração mitocondrial, capacidade respiratória e fenótipo de energia, que descreve a via preferencial de energia para responder ao estresse. PBMCs frescos estão prontamente disponíveis na prática clínica usando padrão flebotomia. O ensaio todo descrito neste protocolo pode ser concluído em menos de 4 horas sem o envolvimento de técnicas bioquímicas complexas. Além disso, descrevemos um método de normalização que é necessário para a obtenção de dados podem ser reproduzidos. Os métodos de procedimento e normalização simples apresentados permitem para coleta de amostra repetida do mesmo paciente e geração de dados reprodutíveis que podem ser comparados entre os pontos de tempo para avaliar os efeitos potenciais do tratamento.

O teste de estresse de Mito baseia-se em medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) após injeção sequencial de vários inibidores respiratórias para mapear um perfil mitocondrial completo. Medições de OCR após cada injecção de droga pode ser usada para calcular os seguintes parâmetros relacionados com a saúde mitocondrial: OCR Basal mede-se primeiro antes de qualquer injeção de drogas para avaliar o consumo de oxigênio necessário para atender a demanda de A...

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Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo prático para avaliar disfunção mitocondrial associada a fadiga em pacientes com câncer. Este protocolo inovador é otimizado para uso clínico envolvendo flebotomia só padrão e os procedimentos básicos de laboratório.

Avaliando o papel da função mitocondrial em fadiga relacionadas ao câncer

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K visualizações.  National Institutes of Health. Nosso objetivo foi desenvolver um protocolo prático para avaliar disfunção mitocondrial associada a fadiga em pacientes com câncer. Este protocolo inovador é otimizado para uso clínico envolvendo flebotomia só padrão e os procedimentos básicos de laboratório.

Vídeo: Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

Ultrassonográfico Avaliação do linfedema relacionados com o cancro da mama

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Pesquisa do câncer

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer therapies, such as radio- and chemotherapy, introduce enormous amount of additional DNA damage, leading to cell cycle arrest and apoptosis to limit cancer progression. Quantitative assessment of DNA damage during experimental cancer therapy is a key step to justify the effectiveness of a genotoxic agent. In this study, we focus on a single cell electrophoresis assay, also known as the comet assay, which can quantify single and double-strand DNA breaks in vitro. The comet assay is a DNA damage quantification method that is efficient and easy to perform, and has low time/budget demands and high reproducibility. Here, we highlight the utility of the comet assay for a preclinical study by evaluating the genotoxic effect of olaparib/temozolomide combination therapy to U251 glioma cells.

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

The comet assay is an efficient method to detect DNA damage including single and double-stranded DNA breaks. We describe alkaline and neutral comet assays to measure DNA damage in cancer cells to evaluate the therapeutic effect of chemotherapy.

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

Modelo de matriz extracelular óssea tridimensional para osteossarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to interference with proper development and may even result in initiation or progression of cancers in certain cases. Because this pathway serves complex and versatile functions, it can be studied extensively through many different approaches. Of these, bioinformatics provides an undeniably cost-efficient, approachable, and user-friendly method of study. Bioinformatics is a useful way to extract smaller pieces of information from large-scale datasets. Through the implementation of various bioinformatics approaches, researchers can quickly, reliably, and efficiently interpret these large datasets, yielding insightful applications and scientific discoveries. Here, a protocol is presented for integration of bioinformatics approaches to investigate the role of Notch signaling in ovarian cancer. Furthermore, bioinformatics findings are validated through experimentation.

Bioinformatics is a useful way to process large-scale datasets. Through the implementation of bioinformatics approaches, researchers can quickly, reliably, and efficiently obtain insightful applications and scientific discoveries. This article demonstrates the utilization of bioinformatics in ovarian cancer research. It also successfully validates bioinformatics findings through experimentation.

Integração de abordagens de bioinformática e validações experimentais para entender o papel da sinalização de notch no câncer de ovário

Notch signaling is a highly conserved regulatory pathway involved in many cellular processes. Dysregulation of this signaling pathway often leads to ...

Measuring the Motor Aspect of Cancer-Related Fatigue using a Handheld Dynamometer

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on self-report questionnaires which are subject to report and recall biases. Objective measurements using a handheld dynamometer, or handgrip device, have been shown in recent studies to correlate significantly with subjective self-reported fatigue scores. However, variations of both the handgrip fatigue test and fatigue index calculations exist in the literature. The lack of standardized methods limits the utilization of the handgrip fatigue test in the clinical and research settings. In this study, we provide detailed methods for administering the physical fatigue test and calculating the fatigue index. These methods should supplement existing self-reported fatigue questionnaires and help clinicians assess fatigue symptom severity in an objective and quantitative manner.

Simple and accessible methods were developed to measure the motor aspect of cancer-related fatigue objectively and quantitatively. We describe, in detail, ways to administer the physical fatigue test using a simple handgrip device as well as methods to calculate fatigue indices.

Medindo o aspecto motor da fadiga relacionada ao câncer usando um dinamômetro portátil

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Mapeando as Relações Estrutura-Função de Fatores de Transcrição Oncogênica Desordenados usando análise transcriômica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...