Este protocolo fornece orientação precisa passo a passo para lançar a vasculatura arterial pulmonar em camundongos adultos e pós-natais precoces. Esta técnica permite que os usuários lancem integralmente toda a rede vascular para visualização por uma variedade de métodos, incluindo microCC, mantendo a integridade dos tecidos moles. Esta técnica é particularmente útil para olhar para morfologia pulmonar-vascular e arquitetura, mas pode ser facilmente adaptada para o alvo de outros leitos vasculares.
Como muitas cirurgias e dissecções, não há substituto para realmente visualizar um procedimento, e os espectadores podem se beneficiar de ver algumas das manobras mais desafiadoras que estão sendo realizadas. Uma vez que o processo xifoide é exposto, segure suavemente e eleve a caixa torácica. Faça cuidadosamente uma incisão no diafragma semi-transparente e agora exposto.
Os pulmões entrarão em colapso visivelmente, e se afastarão do diafragma. Depois de expor o pulmão e a traqueia, rosca de 15 centímetros de tubo PE10 sobre o cubo de uma agulha de calibre 30. E anexar esta unidade a uma seringa de um mililitro, contendo 10 ao molar 4 de nitroprusside de sódio, em PBS.
Avance o êmbolo para preparar a tubulação até que todo o ar tenha sido purgado. Como uma alternativa eficaz ao texto, penetrar o ápice do coração de um lado, e passar as pontas de fórceps curvas através do músculo, e para fora do outro lado do tecido. Segure uma extremidade de um comprimento de 10 centímetros de seda 7-0, e puxe aproximadamente dois centímetros através do tecido.
Depois de amarrar a sutura, use os oito centímetros restantes de sutura para puxar o coração caudalmente. E grave a ponta da sutura no quadro cirúrgico. Enganche as pontas dos fórceps curvos sob a aorta ascendente e o tronco da artéria pulmonar.
E puxe um comprimento de três centímetros de seda de 7-0 de volta através da abertura para criar uma sutura de lançamento único. Use uma tesoura para fazer uma incisão de um a dois milímetros em direção ao ápice do coração, penetrando no ventrículo direito de parede fina. E introduza a tubulação preparada no ventrículo direito, avançando suavemente o cateter no tronco semi-transparente e de parede fina da artéria pulmonar.
Verifique visualmente se o cateter não avançou nos ramos pulmonar esquerdo ou direito, e não apontou o ponto do ramo da artéria pulmonar. Tape a porção distal da tubulação na placa cirúrgica, e aperte suavemente a sutura solta em torno de ambos os grandes vasos. Corte a peça de oito centímetros de sutura para devolver o coração a uma posição de repouso natural.
E corte o oráculo esquerdo do coração para permitir que o perfusado saia da vasculatura. Em seguida, use uma bomba de seringa, para infundir o nitroprusside de sódio a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min para lavar o sangue, e dilatar a vasculatura, até que o perfusato se esclaie. Para construir a unidade de inflação pulmonar, corte o cateter intravenoso de plástico flexível de 24 bitolas de uma banheira e conecte-se à agulha de um conjunto de infusão de borboletas.
Conecte esta unidade à torneira e conecte a torneira a uma seringa aberta de 50 mililitros. Depois de carregar a seringa com formalina e escorrizar o cateter, com a torneira fechada, posicione a seringa em um suporte de anel, ao ponto em que o menisco está 20 centímetros acima da traqueia. Coloque duas suturas soltas, de dois a quatro milímetros de distância, inferiores à cartilagem cricoide, e use uma tesoura para fazer uma pequena incisão no ligamento cricothiroide, superior às suturas.
Insira o cateter na abertura e avance a ponta além das duas suturas soltas. Aperte as suturas ao redor da traqueia, e abra a torneira para permitir que a formalina entre nos pulmões pela gravidade. Espere cinco minutos para os pulmões inflarem completamente.
Se os pulmões aderirem à caixa torácica durante a inflação, use fórceps de ponta bruta para agarrar o lado de fora da caixa torácica, e mova as costelas em todas as direções para ajudar a liberar os lóbulos sem fazer contato direto com os pulmões. Após cinco minutos, retraia o cateter atrás da primeira sutura e ligadura. Em seguida, retraia o cateter atrás da segunda sutura e ligadura.
Os pulmões devem agora ser inflados em um estado fechado e pressurizado. Para lançar a vasculatura, carregue um mililitro de uma solução 8-1-1 de agente de cura diluente de polímero em uma seringa de um mililitro. E insira cuidadosamente o êmbolo.
Com a seringa invertida, pressione o êmbolo para remover o ar, e para permitir a formação de um menisco na ponta da seringa. Remova a seringa nitroprusside de sódio do cubo da agulha, e gotejar pbs adição no cubo, para criar um menisco. Junte-se à seringa composta por polímero ao cubo e inicie a infusão a 0,02 milímetros por minuto.
Monitore o composto enquanto ele se move livremente através da tubulação, observando o volume da seringa ao entrar no tronco da artéria pulmonar. Continue a profusão até que todos os lóbulos estejam completamente cheios, até o menor navio. Pare a bomba e, mais uma vez, observe o volume da seringa.
Cubra os pulmões com um lenço de limpeza de fibra óptica e aplique liberalmente PBS. Deixe o espécime ficar imperturbável por 30 a 40 minutos em temperatura ambiente. Uma vez que o composto de polímero esteja curado e endurecido, corte os membros e a metade inferior do mouse.
E coloque a cabeça e o tórax em uma formalina conônica de 50 mililitros, durante a noite. Na manhã seguinte, segure a traqueia para separar suavemente o coração e a unidade pulmonar da caixa torácica e tórax restantes. Coloque o bloco de tecido colhido em um frasco de cintilação cheio de formalina.
Um elenco bem sucedido resultará em um preenchimento uniforme de toda a rede arterial pulmonar. Se houver danos nas vias aéreas pulmonares ou pulmonares, pequenos vazamentos impedirão que os pulmões ressuquem a pressão. O enchimento irregular ou incompleto pode surgir de uma câmara de ar como resultado do ar ser introduzido no sistema vascular através do cateter, bloqueando o fluxo a jusante do composto.
O enchimento ocorre quando um composto muito pequeno é introduzido na vasculatura. Alternativamente, o excesso de enchimento, ou a introdução de muito composto de polímero muito rapidamente, pode causar ruptura arterial, ou, mais comumente, trânsito venoso. Avançar o cateter muito longe do tronco pulmonar pode fazer com que a ponta se enraizar em um ramo da artéria pulmonar, criando um desequilíbrio no fluxo, e fazendo com que um lado encha mais rápido que o outro.
O desempenho cuidadoso da técnica como demonstrado, utilizando o monitoramento direto adequado dos pontos finais de vasculatura distal, e as taxas de infusão padrão podem resultar em preenchimento ideal da vasculatura pulmonar. Além disso, adaptar essa técnica à vasculatura sistêmica pode produzir resultados igualmente favoráveis em outros leitos vasculares. Após a fundição, as amostras podem ser processadas para digitalização de tomografias microcomputadas.
Para pós-processamento, um pacote de software comercial pode ser usado para gerar uma renderização de volume 3D da árvore pulmonar-vascular. Ao tentar esta técnica pela primeira vez, tenha especialmente cuidado ao redor dos pulmões frágeis e da artéria pulmonar. O mais importante é evitar introduzir ar no circuito vascular.
Seguindo um elenco bem sucedido, uma amostra pode ser escaneada por micro-CT, e questões envolvendo morfometria vascular e arquitetura podem ser exploradas.
