Este protocolo fornece análise em tempo real de duas principais vias bioenergénicas: respiração mitocondrial e glicolise em tecidos retinas de camundongos ex vivo recém-dissecados. A análise tradicional de cavalos marinhos foi focada em células monocamadas cultivadas, enquanto este protocolo permite que os pesquisadores estudem a atividade mitocondrial em tecidos recém-dissecados, especificamente a retina. Esta técnica é usada para estudar as atividades das mitocôndrias e bandeiras de glicolise em retinas de modelos herdados de camundongos de degeneração da retina.
É uma ferramenta útil para a pesquisa da retina e também tem potencial para ser aplicado a outro tipo de tecido para desenvolver terapias potenciais. A parte mais difícil deste protocolo é obter discos de perfuração de qualidade da retina do rato recém-dissecada, por isso recomenda-se que o indivíduo que irá executar esta técnica tenha boas habilidades de dissecação de retina. Um dia antes do experimento, abra o do cartucho do sensor e adicione um mililitro de meio de calibração a cada poço da placa de utilidade.
Incubar durante a noite em uma incubadora sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius para ativar os fluoroforos. No dia do experimento, prepare o meio de ensaio em drogas compostas diluídas do estoque. Aqueça o meio de ensaio no banho de água de 37 graus Celsius.
Configure o programa de ensaio na máquina conforme descrito no manuscrito do texto. Abra a tampa do contendo pastilhas de malha. Pipeta oito microliters da mistura de revestimento para cada inserção de malha, em seguida, use uma ponta de pipeta para espalhar suavemente a gota ao redor para distribuir a mistura de revestimento igualmente ao longo da inserção da malha.
Feche o e deixe as pastilhas de malha incubarem à temperatura ambiente por pelo menos 25 minutos para absorção. Após a incubação, lave as pastilhas de malha ao pipetar quatro mililitros do meio de ensaio diretamente nas pastilhas. Agite suavemente o para garantir que todas as pastilhas de malha sejam lavadas com o meio de ensaio.
Para preparar o soco da retina, enuclear os olhos de um rato adulto eutanizado e colocá-los em PBS gelado em uma placa de Petri, em seguida, colocar a placa de Petri sob um microscópio de dissecção. Usando microscisores, corte o nervo óptico e remova cuidadosamente os músculos extrarreectus ligados fora do globo ocular. Usando uma agulha calibre 30, faça um buraco na borda da córnea.
Em seguida, use microscissores de dissecção fina para fazer um corte circular ao longo da borda da córnea. Usando fórceps de dissecção afiadas, remova a córnea, a lente e o humor vítreo do copo dos olhos. Faça vários pequenos cortes na camada escleral na borda do copo ocular usando microscissores de dissecção fina.
Use dois fórceps de dissecção afiados para segurar o tecido escleral de cada lado e puxe a camada escleral com muito cuidado para removê-lo da retina neural. Repita isso ao redor do copo ocular até que toda a esclera seja removida e um copo de retina intacto seja obtido. Faça cortes radiais no copo de retina para achatá-lo e gerar várias seções distintas usando microscissores de dissecção.
Em seguida, usando um perfurador de biópsia de um milímetro de diâmetro, corte um disco de retina de cada seção do copo de retina achatado. Soco a uma distância igual da cabeça do nervo óptico. Transfira as pastilhas de malha pré-revestidas para a placa de dissecção Petri usando fórceps.
Com a ajuda de dois pincéis de cílios super finos, coloque o disco de perfuração de retina no centro da inserção da malha com a camada de célula de gânglio lado para baixo tocando a malha e a camada fotorreceptora voltada para cima. Para carregar o cartucho do sensor, tire o da placa do cartucho do sensor hidratado da incubadora Celsius de 37 graus. Depois de remover a tampa do propulsor hidráulico, coloque o cartucho do sensor de volta na placa de utilidade.
Carregue o volume desejado de soluções compostas de injeção em portas apropriadas, segurando a ponta pipeta em um ângulo de 45 graus, inserindo a ponta da pipeta no meio do caminho em uma porta de injeção com o bisel da ponta contra a parede oposta da porta de injeção. Carregue suavemente o composto em cada porta. Carregue o cartucho do sensor na máquina para calibração clicando no botão iniciar a execução para abrir a bandeja da máquina.
Coloque o cartucho do sensor na máquina e clique em Estou pronto botão para iniciar a calibração. Carregue o volume desejado do meio de ensaio em cada poço da placa de captura de ilhotas. Usando fórceps, pegue a borda da inserção de malha contendo discos de perfuração de retina e retire-o da placa de Petri.
Bata levemente a parte inferior da inserção da malha em um tecido absorvente para remover líquido extra e coloque-o no poço da placa de captura de ilhotas. Repita esta etapa até que todas as pastilhas de malha com socos de retina sejam colocadas na placa de captura de ilhotas que preenche os poços de correção de fundo e poços em branco com pastilhas de malha vazias. Usando duas fórceps Graefe, pressione a borda de cada malha inserir cuidadosamente e suavemente, certificando-se de que estes estão inseridos com segurança na parte inferior da placa de captura de ilhotas.
Coloque a placa de captura de ilhota carregada em uma incubadora Celsius de 37 graus por cinco minutos para aquecer e ejete a placa de utilidade após a calibração estiver completa. Substitua-a pela placa de captura de ilhota contendo socos na retina e retome a execução do ensaio clicando no botão da placa da célula de carga. Depois que a execução estiver concluída, ejete a placa de captura do sensor e a placa de captura de ilhotas contendo socos de retina clicando no botão ejetar ejetar, em seguida, clique no botão feito para que os dados seja automaticamente salvo como um arquivo ASYR e a mudança de tela automaticamente para a exibição do resultado.
O ensaio de estresse mitocondrial mostrando um traço de OCR e um ensaio de taxa glicolítico mostrando traços de OCR e ECAR foram realizados usando discos de perfuração de retina de um milímetro recém-dissecados. No ensaio de estresse mitocondrial, Bam15 foi injetado para desacoplar gradiente de prótons da produção de ATP mitocondrial, resultando no aumento do OCR para o nível máximo. Rotenona e antimicina A foram injetados para inibir a respiração das mitocôndrias no complexo um e complexo três, respectivamente, resultando em uma queda do OCR para o nível mínimo.
A diferença entre o nível máximo de OCR e a última medição do nível basal de OCR reflete a capacidade de reserva mitocondrial. No ensaio da taxa glicóltica, a injeção de rotenona e antimicina A desliga a respiração mitocondrial e aumenta a glicólise. A glicólise é apreendida injetando 2-desoxi-d-glicose, que compete com glicose para a ligação hexokinase, fazendo com que o ECAR caia para o nível mínimo.
A diferença entre o nível máximo de Glyco ECAR na última medida do nível basal Glyco ECAR reflete a capacidade de reserva de glicolise. Para produzir dados confiáveis, é fundamental obter uma boa qualidade dos discos de perfuração de retina e limitar o tempo total de dissecação dentro de 1,5 hora. Após o experimento, pode-se quantificar o DNA do conteúdo proteico de um disco de retina em um poço e usá-lo para normalizar os dados dos cavalos-marinhos.
Assim, este protocolo foi utilizado para estudar o desenvolvimento, o envelhecimento e a doença na retina. Também foi analisada a preferência ou dependência de diferentes substratos de combustível, como glicose ou ácidos graxos.
