Agradecemos A Sra. Tess J. Lameyer, A Sra. Ruth Frank, e o Dr. Michael A. Muniak por edições e comentários, e o Dr. Ryohei Yasuda no Max Planck Florida para o software de aquisição 2pFLIM. Este trabalho foi apoiado por dois prêmios BRAIN Initiative U01NS094247 (H.Z. e TM) e R01NS104944 (H.Z. e TM), um R01 Grant R01NS081071 (TM), e um R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Todos os prêmios são do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e Stroke, Estados Unidos.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Oregon Health and Science University.
1. configuração do microscópio 2pFLIM
<ol><li>Instale um módulo de contagem de temporização de fóton (PTCM, tabela de materiais) e conecte-se ao computador (Figura 1) de acordo com o manual do fabricante. Nota: O PTCM é tipicamente uma placa do computador que receba uma entrada da "sincronização" para o sincronismo do pulso do laser e uma entrada do fóton do tubo do photomultiplicador (PMT). Ele também recebe tempo de clock para pixels, linhas e quadros, de software de controle de imagem de dois fótons. O PTCM usa os sinais de relógio para separar fótons individuais em diferentes pixels e quadros.</li>
	<li>Adicione um fotodiodo com > largura de banda de 200 MHz para medir o sincronismo do laser. Coloque uma lamínula de vidro padrão no trajeto da luz para refletir uma pequena fração da luz do laser no fotodiodo colocado perpendicularmente ao trajeto da luz (Figura 1). Ligue a saída do fotodiodo à entrada "Sync" do PTCM. Nota: Muitos lasers modernos também output o sincronismo do laser. Para estes lasers, o fotodiodo não é necessário, e um pode diretamente conectar a saída do sincronismo do laser à entrada da sincronização do ptcm.</li>
	<li>
Troque o PMT, no caso do tAKARα, o canal verde PMT, com um PMT GaAsP de baixo ruído e rápido (Figura 1). Ligue a saída PMT à entrada de sinal do PTCM.
	<ol>
<li>Adicione um divisor opcional do sinal (Figura 1) se a aquisição simultânea da intensidade através do canal convencional da imagem latente do dois-fotão é desejada. Conecte a saída de PMT ao divisor do sinal e conecte a saída do divisor ao PTCM e ao módulo convencional da imagem latente do dois-fotão. Nota: Os PMTs de GaAsP dão uns sinais mais rápidos do único-fotão do que PMTs convencionais do bialcalóide e permitem uma determinação mais exata do sincronismo do fóton. Determinados modelos de PMTs de GaAsP podem ser refrigerados a 10 − 35 ° c abaixo da temperatura ambiental, permitindo a supressão de contagens escuras a um nível abaixo de algumas cem por segundo (tipicamente ≤ 200 contagens/s). Este baixo nível de ruído é importante para a medida precisa de tempos de vida da fluorescência porque as contagens do fóton do ruído não podem facilmente ser distinguidas ou subtraída da curva da vida da fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicionar um filtro de emissão de fluorescência de banda-Pass que minimiza a contaminação espectral, se houver, do aceptor fluoróforo. Por exemplo, para takarα, um filtro de barreira de 500 nm ± 20 nm para o canal verde é usado para reduzir a contaminação do Acceptor Sreach, que é uma proteína fluorescente amarela (QY ~ 0, 7) escura (YFP)29,30. Conecte os sinais de temporização, como os pulsos de disparo para pixéis, linhas, e frames individuais da imagem, conforme apropriado ao software de controle e descrito no manual do usuário PTCM. Instale o software de controle e aquisição de dados apropriado. Nota: Alguns fabricantes de PTCM (tabela de materiais) fornecem seu software para a imagem latente 2pflim. Aqui, o software feito encomenda chamado FLIMimage é usado, que foi desenvolvido pelo laboratório de Yasuda (Max Planck Florida, através da comunicação pessoal). Este software funciona como uma função de usuário Add-on para determinado software de aquisição de dois fótons (tabela de materiais). Controla e comunica-se com o PTCM no sincronismo apropriado durante a imagem latente do dois-fotão para adquirir imagens 2pFLIM.</li>
</ol>2. construção de uma esteira motorizada
Nota: O design da esteira motorizada personalizada é mostrado na Figura 2.
<ol><li>Corte um rolo de espuma (Ø = 200 mm) a 150 mm de comprimento com uma serra fina. Alternativamente, Cole as duas metades de uma bola de espuma juntas e coloque fita sobre a costura. Opcionalmente, Cole uma esteira de borracha com perfil no rolo para aumentar a tração no rolo.</li>
	<li>Perfure um furo do diâmetro de 1/4 polegadas através do centro do rolo no lado liso do rolo ou perfure um furo do diâmetro de 1/4 polegadas através do meio de cada metade da esfera se a esfera da espuma é usada.</li>
	<li>
Instale um eixo de aço do diâmetro de 1/4 polegadas através do furo. Cole o rolo de espuma/bola para o eixo usando espuma-compatível cola. Opcionalmente, modifique dois acoplamentos flexíveis do eixo (diâmetro interno de 1/4 polegadas) para reforçar o acoplamento do eixo ao rolo/esfera de espuma. Nota: Anote por favor que muitas colas comuns podem dissolver a espuma.<ol>
<li>Para cada acoplamento do eixo, posicione o acoplamento do eixo em seu lado liso e no centro da placa de metal do retângulo (0,7 milímetros x 15 milímetros x 76 milímetros). Soldar a chapa ao acoplamento do eixo. Perfure um furo de 1/4 polegadas no centro da placa para permitir a instalação do acoplamento de eixo modificado sobre ao eixo e dos dois furos de parafuso na placa de metal lateral do centro.</li>
		<li>Instale o acoplamento do eixo no eixo contra o rolo de espuma/bola. Se usar este último, Dobre levemente a placa para caber a curvatura da esfera. Coloque os parafusos nos orifícios laterais para fixar o rolo/bola no eixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perfure e bata uma rosca 3/8-32 no centro de uma placa de gaiola e instale o codificador rotativo. Perfure um furo do parafuso na base do suporte do motor do direito-ângulo para permitir o acessório do motor no suporte do borne. Fixe o codificador rotativo e o motor à extremidade do eixo utilizando um acoplamento de eixo flexível.</li>
	<li>Instale a esteira montada em uma placa de pão de alumínio usando postes para o motor e o codificador rotativo (Figura 2). Conecte as entradas do motor ao controlador de velocidade e a saída do codificador rotativo a uma entrada analógica da placa de aquisição de dados do computador (DAQ). Nota: A velocidade angular da rotação é codificada pelo codificador giratório como a tensão e é digitalizada usando o software feito encomenda chamado AnimalTracker escrito em MATLAB.</li>
	<li>Instale o suporte compatível com Headplate em um suporte de ângulo reto. Instale um poste sólido na placa de pão em frente à esteira rolante e instale o suporte montado do Headplate com o suporte de ângulo reto no poste (Figura 2). Assegure-se de que as barras de suporte da placa de cabeceira estejam alinhadas com o eixo de modo que o rato possa adoptar uma posição de pé adequada e confortável na esteira (Figura 2C).</li>
</ol>3. expressão do sensor tAKARα no córtex do rato
<ol><li>
No utero Electroporation
	<ol>
<li>Prepare uma solução de DNA para IUE adicionando 0,2% de concentração final de corante verde rápido (para visualização durante a injeção) a um DNA plasmídeo (3 − 4 μg/μl; as construções do sensor contendo um promotor CAG, seqüência de sensores e um vírus da hepatite de marmota elemento de resposta pós-transcricional [WPRE] potenciador translacional) dissolvido/diluído em água ou Tris-EDTA.</li>
		<li>Prepare um rato fêmea grávido cronometrado (por exemplo, C57BL/6) para IUE em E1624. Anestesie o camundongo com isoflurano (4% para indução e 1,5% para manutenção, em 95% O2 com 5% CO2) e aplique injeção subcutânea de analgésicos peri-operatórios contendo 5 mg/kg de Meloxicam e 4 mg/kg de bupivacaína. Corte abrir a cavidade abdominal com um bisturi e um par de tesouras e expor cuidadosamente os chifres uterinos.</li>
		<li>Injetar 1 μL de solução de DNA por embrião no ventrículo lateral de um hemisfério, conforme descrito anteriormente24.</li>
		<li>Realize o IUE24 regular para neurônios corticais colocando o pé de extremidade positivo do elétrodo no córtice e usando pulsos quadrados de 5 100-ms (38 V) em 1 Hertz com um electroporator. Nota: as regiões corticais diferentes podem ser alvejadas para o electroporation mudando a colocação do pé de extremidade do elétrodo relativo ao ventrículo lateral.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injeção estereotótaxica
	<ol>
<li>Prepare um rato no dia pós-natal 30 para a cirurgia Stereotaxic26. Anestesiar o rato como descrito no passo 3.1.2., e aplicar injeção subcutânea de analgésicos peri-operatórios contendo 5 mg/kg de carprofeno.</li>
		<li>Diluir o serotipo 2/1 do AAV (AAV2/1) que expressa hsyn-takarα-wpre a um Titer empiricamente determinado (~ 1 x 109− 1 x 1010 genomes/μL) na seringa-filtrada (membrana do acetato de celulose de 0,2 μm) Saline fosfato-tamponado.</li>
		<li>Perfure um furo do diâmetro do ~ 500 μm usando uma broca handheld um estereomicroscópio nas seguintes coordenadas para o córtice de motor: 0,5 milímetros anterior a Bregma, 1,2 milímetros lateral ao Midline.</li>
		<li>Monte um injector (por exemplo, manipulador hidráulico do óleo, com o suporte feito-à-medida do êmbolo/pipeta de vidro) a um manipulador motorizado. Coloque a agulha de injeção em um ângulo de 15 ° em relação ao plano de Bregma-lambda. Programe um movimento diagonal entre os eixos x e z equivalentes a uma progressão de 700 μm e 200 μm ao longo dos eixos ântero-posterior e dorsal-ventral, respectivamente. Nota: Para evitar danos ao tecido diretamente acima do campo de imagem pretendido, as partículas de AAV são injetadas em um ângulo relativo ao plano de Bregma-lambda.</li>
		<li>Posicione a ponta da agulha de injeção na pia no centro do orifício de perfuração e execute lentamente o movimento diagonal (~ 25 μm/s) descrito acima. Este procedimento posicionará o centro de injeção a 1,2 mm anterior a Bregma, 1,2 mm lateral à linha média, 0,2 mm abaixo da pia.</li>
		<li>Injetar 20 nL de partículas virais diluídas (~ 10 nL/min). Aguarde pelo menos 10 min e retraia lentamente a agulha de injecção (~ 12,5 μm/s).</li>
		<li>Termine o procedimento da injeção Stereotaxic e cola/sutura a pele26.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. instalação da janela craniana
<ol><li>Realize a colocação da janela craniana em camundongos expressando tAKARα via IUE (seção 3,1) ou injeção estereotaxica de partículas virais (seção 3,2), entre os dias pós-natal 30 e 60. Para o rato infectado com partículas virais, implemente a janela craniana pelo menos duas semanas após a injecção de vírus. Instale a janela craniana como descrito anteriormente27,28, com os seguintes detalhes. Anestesie o rato como descrito no passo 3.1.2., e aplique injeção subcutânea de analgésicos peri-operatórios 0, 75 mg/kg Buprenex e agente anti-inflamatório dexametasona a 4 mg/kg.</li>
	<li>Retire o periósteo e retrair o músculo do pescoço. Cole a borda da pele ao crânio com o adesivo do tecido para evitar a exposição da musculatura da garganta após a cirurgia.</li>
	<li>Seque e retire qualquer periósteo do crânio, raspando suavemente usando um bisturi. Coloque a placa de imagem (diâmetro interno de 8 mm) para cercar o campo de imagem pretendido. Cole o Headplate ao crânio usando a colagem cyanoacrylate-baseada, seguida pelo cimento acrílico dental. Para a aderência óptima, assegure-se de que o Headplate repouse sobre o crânio exposto e secado. O acelerador de cola pode ser usado para acelerar o endurecimento.</li>
	<li>Desenhe um círculo de 5 mm de diâmetro acima do campo de imagem pretendido (coordenadas especificadas no passo 3.2.3) utilizando uma broca dentária e exponha a dura-máter.</li>
	<li>Aplique uma camada fina de polímero transparente, também chamado de dura artificial, para a superfície dura para cobrir toda a janela craniana. O polímero protegerá e estabilizará a dura-máter. Coloque uma lamínula circular estéril (5 mm de diâmetro) na dura-máter. Fixe o lamela com a colagem do cianoacrilato aplicada em torno das bordas da janela seguidas pelo cimento acrílico dental.</li>
</ol>5. in vivo microscopia de imagem vitalícia de fluorescência de dois fótons
<ol><li>Iniciar a imagem 2pFLIM em ou além de 2 semanas após a instalação da janela craniana (seção 4). Minimize a interferência experimental devido ao stress pelo manuseio frequente e esfregar o mouse antes do início do estudo de imagem para habituar o mouse.</li>
	<li>Ajuste o comprimento de onda do laser da excitação do dois-fotão a 960 nanômetro usando o software que controla o laser do dois-fóton.</li>
	<li>Anestesialize o rato utilizando isoflurano a 4%. Confirme a anestesia adequada pela cauda-pitada e observando as taxas de respiração. Ou seja, não deve haver resposta à cauda-pitada e a taxa de respiração deve ser reduzida para ~ 1 respiração por segundo. Para minimizar o tempo processual desnecessário e porque a anestesia dura somente por dois a três minutos, os lubrificantes do olho não são usados.</li>
	<li>Transfira o rato anestesiado para a esteira motorizada (Figura 2C) e monte a cabeça do rato no suporte do cabeçote da instalação da esteira (veja a Figura 2 para mais detalhes). Limpe a superfície da lamínula craniana do rato com 70% de etanol.</li>
	<li>Coloque a esteira motorizada com o mouse montado o objetivo 2pFLIM. Aplique uma gota de água destilada entre a lamínula de janela craniana e o objetivo.</li>
	<li>Deixe o rato montado acordar da anestesia e tornar-se aclimado ao ambiente de esteira e microscópio por pelo menos 10 min. monitorar a taxa de respiração do mouse enquanto o mouse montado acorda da anestesia.</li>
	<li>Navegue até o local da injeção epi-iluminação. Documente características de recursos (i.e., vasos sanguíneos) brightfield para ajudar a imagem latente da mesma região de interesse (ROI) durante sessões subseqüentes da imagem latente.</li>
	<li>Elimine toda a luz entrante à excepção da luz emitida do tecido de cérebro. Desligue a fonte luminosa epi-iluminação e feche o compartimento do equipamento 2pFLIM. Ative o 2pFLIM PMT ligando o controle de tensão do comando de hardware.</li>
	<li>Adquira uma imagem z-Stack 2pFLIM usando o software de aquisição 2pFLIM FLIMimage com as seguintes configurações recomendadas para imagens de SOMATA tAKARα-positivas em camundongos acordados. Defina a média do quadro para 3 frames, a velocidade de digitalização para 2 MS/linha, tamanho da imagem para 128 x 128 pixels e campo de visão para 90 − 100 μm. Ajuste as configurações de imagem com base na configuração de preparação e hardware.</li>
	<li>
Inspecione a imagem adquirida no FLIMview (software personalizado desenvolvido em casa; ver secção 6). Ajuste as configurações de imagem após a etapa 5,9 para otimizar a contagem de fótons e minimizar o fotobranqueamento. Nota: Uma contagem integrada praticável do fóton em um ROI para a imagem latente da vida de um soma tAKARα-positivo in vivo é ~ 1000 − 10000 fótons dependendo da amplitude do sinal que resulta de um estímulo particular (veja a discussão).<ol>
<li>Quando necessário, use um campo de visão diminuído, velocidade de digitalização diminuída, aumento da potência do laser e aumento do número de quadros a serem calculados para aumentar as contagens de fótons integrados e reduzir o erro de estimativa de vida útil. Ao mesmo tempo, certifique-se de usar a potência mínima essencial do laser, a média do quadro e a velocidade de digitalização para minimizar o fotobranqueamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imagem em um intervalo de tempo regular (por exemplo, cada 30 − 60 s) repetindo a aquisição da pilha z usando as configurações determinadas na etapa 5,10. Adquira imagens de 2pFLIM de linha de base por pelo menos 15 min em velocidade de esteira zero.</li>
	<li>Defina a velocidade de rotação da esteira para ~ 15 cm/s por 15 min ao adquirir imagens 2pFLIM. Continuar a imagem por ≥ 20 min após desligar a rotação da esteira rolante, para avaliar a duração da atividade de PKA após a cessação da locomoção forçada.</li>
</ol>6. análise de imagens 2pFLIM
<ol><li>
Abra as imagens adquiridas no FLIMview e defina os seguintes parâmetros no FLIMview. Observação: os detalhes do parâmetro são descritos em discussion.<ol>
<li>Clique no mínimo de contagem de fótons (SPC) campos mínimos e máximos de intervalo no FLIMview. Incorpore o valor mínimo e máximo apropriado da escala do SPC, tipicamente variando entre 1.2 − 2 e 10 − 12 NS, respectivamente.</li>
		<li>Estale sobre o campo do valor de t0 no FLIMview e incorpore o valor de t0 (tipicamente ~ 2 ns). Clique no campo de valor de limiar mínimo de luminância vitalícia no FLIMview e introduza o valor de limiar pretendido para 5 − 30 fótons.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clique no novo botão de grupo (N) e atribua um nome de grupo de experimento. Isso gerará um grupo que combina dados de cada imagem FLIM adicionada.</li>
	<li>Estale sobre o botão do ROI no módulo dos controles do ROI de flimview e desenhe um ROI em torno de um soma takarα-positive. Reduza o intervalo z-Stack, movendo o limite z inferior e superior nos controles deslizantes de controle de pilha z no FLIMview, para minimizar a contaminação do sinal proveniente de fótons de fundo em outras profundidades z.</li>
	<li>Clique no botão + para adicionar a imagem flim ao grupo (etapa 6,2). Clique no botão Calc para calcular a duração média (lt, também chamada de tempo médio de emissão de fóton [MPET]), para o ROI e o erro de estimativa vitalícia (δτ).</li>
	<li>Abra o próximo arquivo na série de imagens cronical 2pFLIM. Repita o passo 6,4. Certifique-se de ajustar a posição do ROI e do intervalo z-Stack para medir o mesmo soma tAKARα positivo ao longo do tempo, porque pode haver deriva de tecido ao longo do tempo.</li>
	<li>Selecione o Deltampet/MPET0 no menu suspenso do módulo de controles de grupo . Clique no campo # de linha de base e insira o índice (es) (por exemplo, 1 2 3 4 5 para as primeiras cinco imagens no grupo criado na etapa 6,3). Isso definirá as imagens usadas para calcular o tempo de vida da linha de base (LT0).</li>
	<li>Clique em plotar para gerar um gráfico contendo a resposta FLIM (δlt/lt0) de takarα durante o experimento no Rois definido. Alterações normalizadas no tempo de vida (ΔLT) de ROIs individuais pelo tempo de vida basal correspondente (LT0) permitem a comparação da atividade de pKa durante a locomoção em diferentes Rois.</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liberated+PKA+Catalytic+Subunits+Associate+with+the+Membrane+via+Myristoylation+to+Preferentially+Phosphorylate+Membrane+Substrates.">Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates.</a> Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).</li><li>Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+cAMP-dependent+protein+kinase+bound+to+microtubule-associated+protein+2.">Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+dynamics+of+type+II+PKA+in+neurons.">Subcellular dynamics of type II PKA in neurons.</a> Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li><li>Baumgart, J., Baumgart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortex-,+Hippocampus-,+Thalamus-,+Hypothalamus-,+Lateral+Septal+Nucleus-+and+Striatum-specific+In+utero+Electroporation+in+the+C57BL/6+Mouse.">Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. 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(12), 18-19 (2008).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+and+quantitative+FRET-FLIM+imaging+in+single+dendritic+spines+using+improved+non-radiative+YFP.">Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP.</a> Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).</li><li>Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dark+green+fluorescent+protein+as+an+acceptor+for+measurement+of+F&#246;rster+resonance+energy+transfer.">A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of F&#246;rster resonance energy transfer.</a> Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).</li><li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+behavioral+experiments+in+head-fixed+mice.">Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice.</a> PLoS ONE. 9 (2), (2014).</li><li>Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+central+amygdala+controls+learning+in+the+lateral+amygdala.">The central amygdala controls learning in the lateral amygdala.</a> Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+signaling+using+two-photon+fluorescent+lifetime+imaging+microscopy.">Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).</li><li>Mehta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-fluorophore+biosensors+for+sensitive+and+multiplexed+detection+of+signalling+activities.">Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities.</a> Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo demonstra o uso do sensor tAKARα de FRET-FLIM para visualizar a atividade de PKA neuromodulação-disparada em ratos de comportamento cabeça-fixados. Esta aplicação é baseada em testes extensivos e caracterizações de tAKARα in vitro e in vivo para demonstrar que o sinal FLIM obtido é relevante para eventos neuromodulatórios fisiológicos17. Aqui, uma aplicação in vivo, atividade de PKA locomoção induzida no córtex motor, é usada para descrever os procedimentos para e...

A neuromodulação, também conhecida como transmissão sináptica lenta, impõe um forte controle sobre a função cerebral durante diferentes Estados comportamentais, como estresse, excitação, atenção e locomoção1,2,3 4. apesar de sua importância, o estudo de quando e onde os eventos neuromodulatórios acontecem ainda está em sua infância. Neuromoduladores, incluindo acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, e muitos neuropeptídeos, ativam receptores acoplados à proteína G (GPCRs), que por sua vez desencadeiam vias de mensageiro intracelular segundo com uma ampla janela de escalas de tempo variando de segundos a horas. Enquanto cada neuromodulador desencadeia um conjunto distinto de eventos de sinalização, a via de campo/proteína quinase a (PKA) é uma via de downstream comum para muitos Neuromoduladores1,5. O caminho do acampamento/pKa regula a excitabilidade neuronal, a transmissão sináptica e a plasticidade6,7,8,9e, portanto, ajusta a dinâmica da rede neuronal. Como diferentes neurônios ou tipos neuronais expressam diferentes tipos ou níveis de receptores do neuromodulador10, os efeitos intracelulares do mesmo neuromodulador extracelular podem ser heterogêneos em diferentes neurônios e, portanto, devem ser estudado com resolução celular. Até o momento, continua a ser desafiador monitorar eventos neuromodulatórios em neurônios individuais in vivo durante o comportamento.
Para estudar a dinâmica espaciotemporal da neuromodulação, é necessária uma modalidade de gravação adequada. A microdiálise e a voltametria cíclica de varredura rápida são freqüentemente usadas para estudar a liberação de Neuromoduladores, mas não têm a resolução espacial para monitorar eventos celulares11,12. Análoga à dinâmica do cálcio que está sendo usada como um proxy para a atividade elétrica neuronal na imagem latente da população13, a imagem latente de pKa pode ser usada para ler para fora eventos neuromoduladoras através de uma população neuronal na definição celular. O protocolo atual descreve o uso de um repórter melhorado da atividade da um-quinase (AKAR) para monitorar atividades do PKA in vivo durante o comportamento animal. O método descrito aqui permite a imagem latente simultânea de populações neuronal na definição subcellular com uma definição temporal que rastreia eventos neuromodulatórios fisiológicos.
Os akars são compostos por um doador e um aceitador de proteínas fluorescentes ligadas por um peptídeo de substrato de fosforilação de pKa e um domínio associado à forkhead (FHA) que se liga à serina fosforilada ou treonina do substrato14,15. Após a ativação da via PKA, o peptídeo de substrato de AKAR é fosforilado. Como resultado, o domínio FHA liga-se ao peptídeo fosforilado de substrato, trazendo assim os dois fluoróforos em estreita proximidade, referido como o estado fechado de AKAR. O estado fechado de um AKAR fosforilada conduz à transferência aumentada da energia da ressonância de Förster (fret) entre os Fluorophores do doador e do acceptor. Uma vez que a proporção de akars fosforilados está relacionada com o nível de atividade do pKa16, a quantidade de traste numa amostra biológica pode ser utilizada para quantificar o nível de atividade do pKa16,17,18, 19,20.
As versões adiantadas de AKARs foram projetadas primeiramente para a imagem latente ratiométrica de duas cores14. Quando a imagem latente mais profunda no tecido de cérebro, o método raciométrica sofre da distorção do sinal devido à dispersão de luz comprimento de onda-dependente17,18,21. Como discutido abaixo, a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência (flim) elimina este problema porque flim mede somente os fótons emitidos pelo fluoróforo fornecedor18,21. Como resultado, a quantificação de FLIM de FRET não é afetada pela profundidade do tecido17. Além disso, uma variante "escura" (i.e., baixa produção quântica [QY]) do fluoróforo aceptor pode ser usada. Isso libera um canal de cor para facilitar a medição multiplexada de propriedades neuronais ortogonais via imagem simultânea de um segundo sensor ou um marcador morfológico17,19,20.
A imagem latente de flim quantifica o tempo que um fluoróforo gasta no estado excited, isto é, a vida da fluorescência18. O retorno de um fluoróforo ao estado de terra, assim o fim do estado excitado, frequentemente concomitates com a emissão de um Photon. Embora a emissão de um fóton para uma molécula animada individual é estocástica, em uma população a vida média de fluorescência é uma característica desse fluoróforo particular. Quando uma população pura de fluoróforos são excitados simultaneamente, a fluorescência resultante seguirá uma única deterioração exponencial. A constante de tempo desta deterioração exponencial corresponde à vida média da fluorescência, que varia tipicamente de um a quatro nanossegundos para proteínas fluorescentes. O retorno de um fluoróforo doador excited ao estado à terra pode igualmente ocorrer por fret. Na presença de FRET, a vida de fluorescência do fluoróforo do doador é reduzida. Os akars resíduo exibem uma vida fornecedora relativamente mais longa da fluorescência. Após a fosforilação por PKA, o sensor exibe uma vida mais curta porque os fluoróforos doador e aceitador são trazidos perto uns dos outros e FRET é aumentada. A quantificação da vida da fluorescência em uma população de AKARs representa conseqüentemente o nível de atividade de PKA.
As primeiras versões de AKARs não foram usadas com sucesso para a imagem latente in vivo na definição da único-pilha. Isto é principalmente devido à baixa amplitude do sinal dos sensores de AKAR às ativações fisiológicas17. Recentemente, comparando sistematicamente os sensores disponíveis de AKAR para a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão (2pflim), um sensor chamado flim-AKAR foi encontrado para superar sensores alternativos. Além disso, uma série de variantes de FLIM-AKAR chamadas de AKARs direcionados (tAKARs) foram desenvolvidas para visualizar a atividade de PKA em locais subcelulares específicos: microtúbulos (tAKARα), citosol (tAKARβ), actina (tAKARδ), actina filamentosa (tAKARε), membrana (tAKARγ), e densidade pós-sináptica (tAKARζ). Entre tAKARs, tAKARα aumentou a amplitude do sinal eliciada pela norepinefrina por 2,7 vezes. Isso é consistente com o conhecimento de que a maioria dos pKa nos neurônios está ancorada a microtúbulos no estado de repouso22,23. tAKARα foi o melhor intérprete entre os AKARs existentes para 2pFLIM. Além disso, tAKARα detectou atividade fisiologicamente relevante de PKA eliciada por múltiplos Neuromoduladores, e a expressão de tAKARα não alterou as funções neuronais17.
Recentemente, o tAKARα foi usado com sucesso para visualizar as atividades da PKA em camundongos com comportamento fixo de cabeça17. Mostrou-se que a locomoção forçada desencadeou a atividade de PKA no soma de neurônios superficiais da camada (camada 1 a 3, até uma profundidade de ~ 300 μm da pia) no motor, no tambor, e nos córtices visuais. A atividade de PKA locomoção-desencadeada era na parte dependente da sinalização através dos receptores β-adrenergic e dos receptores do dopamine D1, mas não foi afetada por um antagonista do receptor do dopamine D2. Este trabalho ilustra a capacidade de tAKARs para rastrear eventos de neuromodulação in vivo usando 2pFLIM.
No protocolo atual, o método inteiro para a imagem latente da atividade de PKA em ratos acordados cabeça-fixados durante um paradigma forçado da locomoção é descrito em seis etapas. Primeiro, a adição de capacidades 2pFLIM a um microscópio convencional de dois fótons (Figura 1). Em segundo lugar, a construção de uma esteira motorizada (Figura 2). Em terceiro lugar, a expressão do sensor de tAKARα no córtex do rato por in utero Electroporation (IUE) de plasmíos de DNA, ou injeção estereotaxica de vírus adeno-associado (AAV). Os protocolos excelentes para cirurgias para IUE24,25 e a injeção Stereotaxic de partículas virais26 foram publicados previamente. Os principais parâmetros que usamos são descritos abaixo. Adiante, a instalação de uma janela craniana. Os protocolos excelentes foram publicados previamente para a cirurgia da janela craniana27,28. Várias etapas que foram modificadas dos protocolos padrão são descritas. Quinto, realizando in vivo 2pFLIM. Sexto, as análises das imagens 2pFLIM (Figura 3 e Figura 4). Esta aproximação deve prontamente ser aplicável a muitos outros paradigmas comportamentais cabeça-fixos e áreas do cérebro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#956;m cellulose acetate syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-2520</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16x 0.8 NA water-immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP07220</td>
			<td>Step 5.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-pin cable</td>
			<td>US digital</td>
			<td>CA-MIC3-SH-NC</td>
			<td>Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum bread board</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1012</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnimalTracker MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass barrier filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET500-40m</td>
			<td>Step 1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cage plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Step 2.4. Used as mount for rotation sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter</td>
			<td>FST</td>
			<td>19007-05</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular coverslip (5mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101413-528</td>
			<td>Step 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made injection needle holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>Yates Motloid</td>
			<td>44114</td>
			<td>Steps 4.3. and 4.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill; Microtorque ii</td>
			<td>Ram products</td>
			<td>66699</td>
			<td>Steps 3.2.3. and 4.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dowsil transparent polymer</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>3-4680</td>
			<td>Step 4.5. Artificial dura</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation electrode</td>
			<td>Bex</td>
			<td>LF650P5</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Bex</td>
			<td>CUY21</td>
			<td>Step 3.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green FCF</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>Step 3.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMimage MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIMview MATLAB software</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam-compatible glue (Gorilla White Glue)</td>
			<td>Gorilla</td>
			<td>5201204</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headplate holder</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydraulic micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MO-10</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td>KG82648R</td>
			<td>Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-noise fast photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422PA-40 or H10769PA-40</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB 2012b</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor</td>
			<td>Zhengke</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor speed controller</td>
			<td>Elenker</td>
			<td>EK-G00015A1-1</td>
			<td>Step 2.5.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>Step 3.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P14</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PB2</td>
			<td>Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting post bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>C1515</td>
			<td>Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR2</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>&#925;/&#913;</td>
			<td>Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FDS010</td>
			<td>Step 1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photon timing counting module</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>SPC-150</td>
			<td>Step 1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid: tAKAR&#945; (CAG-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119913</td>
			<td>Step 3.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH4</td>
			<td>Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90</td>
			<td>Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation sensor</td>
			<td>US digital</td>
			<td>MA3-A10-250-N</td>
			<td>Step 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber mat</td>
			<td>Rubber-Cal</td>
			<td>B01DCR5LUG</td>
			<td>Step 2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>6208K433</td>
			<td>Steps 2.3. and 2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage 3.6</td>
			<td>Svoboda Lab/Vidrio Technology</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Steps 5.9. and 6.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal splitter</td>
			<td>Becker and Hickl</td>
			<td>HPM-CON-02</td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch)</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>1327K66</td>
			<td>Step 2.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic alignment systsem</td>
			<td>David kopf</td>
			<td>1900</td>
			<td>Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond tissue adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>14006</td>
			<td>Step 3.2.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus: tAKAR&#945; (AAV2/1 hSyn-tAKAR&#945;-WPRE)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>119921</td>
			<td>Step 3.2.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White PE foam roller (8 x 12 inch)</td>
			<td>Fabrication enterprises INC.</td>
			<td>30-2261</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White polystyrene fom ball halves</td>
			<td>GrahamSweet</td>
			<td>200mm diameter 2 hollow halves</td>
			<td>Step 2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipkicker</td>
			<td>PACER</td>
			<td>PT29</td>
			<td>Step 4.3. Hardening accelerator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing protein kinase a activity in head-fixed behaving mice using in vivo two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy

Neuromodulação exerce controle poderoso sobre a função cerebral. A disfunção de sistemas neuromodulatórios resulta em distúrbios neurológicos e psiquiátricos. Apesar de sua importância, as tecnologias para rastrear eventos neuromodulatórios com resolução celular estão apenas começando a surgir. Neuromoduladores, como dopamina, norepinefrina, acetilcolina e serotonina, desencadeiam eventos de sinalização intracelular através de seus respectivos receptores acoplados à proteína G para modular a excitabilidade neuronal, comunicações sinápticas e outros neurônios funções, regulando assim o processamento de informações na rede neuronal. Os Neuromoduladores acima mencionados convergem para a via de campo/proteína quinase A (PKA). Conseqüentemente, a imagem latente in vivo de pKa com definição da único-pilha foi desenvolvida como um leitura para eventos neuromoduladoras em uma maneira análoga à imagem latente do cálcio para atividades elétricas neuronal. Nisto, um método é apresentado para visualizar a atividade de PKA no nível de neurônios individuais no córtice de ratos de comportamento cabeça-fixados. Para fazer assim, um repórter melhorado da atividade da um-quinase (AKAR), chamado tAKARα, é usado, que é baseado na transferência da energia da ressonância de Förster (FRET). Este sensor de PKA genetically-codificado é introduzido no córtice de motor através do Electroporation do utero (IUE) de Plasmids do ADN, ou da injeção Stereotaxic do vírus adeno-associado (AAV). As mudanças do FRET são imaged usando a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão (2pFLIM), que oferece vantagens sobre medidas ratiométricas do FRET para quantificar o sinal do FRET no tecido de luz-espalhamento do cérebro. Para estudar as atividades de PKA durante a locomoção forçada, tAKARα é imaged através de uma janela craniana crônica acima do córtice de ratos acordados, cabeça-fixos, que correm ou descansam em uma esteira motorizada velocidade-controlada. Esta aproximação da imagem latente será aplicável a muitas outras regiões do cérebro para estudar atividades de PKA comportamento-induzidas correspondentes e a outros sensores FLIM-baseados para a imagem latente in vivo.

Os sensores FRET-FLIM permitem a visualização de muitas vias de sinalização diferentes, incluindo a via cAMP/PKA envolvida na neuromodulação. O protocolo atual utiliza o sensor tAKARα recentemente desenvolvido em combinação com 2pFLIM para visualizar as atividades da PKA em camundongos com comportamento fixo na cabeça. A maioria dos microscópios de dois fótons existentes pode ser atualizada com capacidades 2pFLIM adicionando três a quatro componentes, como ilustrado na <stron...

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Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Um procedimento é apresentado para visualizar as atividades da proteína quinase A em ratos cabeça-fixados, comportando-se. Um repórter melhorado da atividade da um-quinase, tAKARα, é expressado em neurônios corticais e tornado acessível para A imagem latente através de uma janela craniana. A microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão é usada para visualizar atividades de PKA in vivo durante a locomoção forçada.

Visualizando proteína quinase uma atividade na cabeça-corrigido ratos comportando-se usando in vivo microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...

Nosso método utiliza uma nova proteína quinase Um sensor chamado alvo A kinase activity reporter alpha, ou tAKAR

visualizing-protein-kinase-activity-head-fixed-behaving-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K visualizações.  Oregon Health & Science University. Nosso método utiliza uma nova proteína quinase Um sensor chamado alvo A kinase activity reporter alpha, ou tAKAR

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Neurociência

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.

Avaliação e manipulação da atividade neural utilizando microscopia holográfica de dois fótons

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Rastreamento de Comportamento e Padrão de Atividade Neural no Prosencéfalo do Peixe-Zebra

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

Autor em destaque: Avanços na pesquisa do cérebro do peixe-zebra adulto 

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...