Os esferoides de células cancerígenas de mama descritos aqui permitirão que os pesquisadores investiguem mecanismos moleculares de interações celulares endoteliais de células cancerosas que estão envolvidas na proliferação e metástase das células cancerosas. A principal vantagem deste modelo 3D é que ele fornece um arranjo celular mais realista que melhora a confiabilidade das inferências em relação à fisiopatologia e tratamento do câncer de mama. Demonstrando o procedimento estará Giovanna Azzarito, doutoranda do meu laboratório.
Comece tratando ou transfectando as células banhadas por 24 horas, ou conforme desejado. Para identificar a distribuição celular em esferoide, lave as células com um mililitro da Solução de Sal Balanceada da Hanks ou HBSS, contendo cálcio e magnésio e fique em HUVECs usando 0,5 microgramas por corante azul mililitro. E as células MCF-7 usando 0,5 mingau verde micromolar diluído no que diz respeito ao meio de crescimento.
Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 30 a 40 minutos. Lave as células com um mililitro de HBSS sem cálcio e magnésio. Em seguida, adicione um mililitro de re-agente de desprendimento enzimático, que é 0,25% trypsin para HUVEC e 0,5% viagens em quatro MCF-7 para cada prato marrom usando uma pipeta P1000.
Eleja cada tipo de célula separadamente em um tubo de poliestireno fundo redondo de cinco mililitros, e adicione um mililitro de soro de bezerro fetal de 10% ou meio FCS usando uma pipeta P1000 para parar a reação enzimática. Em seguida, centrifufique as suspensões celulares a 250 vezes G por cinco minutos. Aspire cuidadosamente o supernatante e suspenda as células em um mililitro de meio livre de esteroides.
Use 100 microlitres de cada suspensão celular diluídos com 10 mililitros de Diluent 2 para determinar o número total da célula. Ligue a máquina e lave pressionando a função e inicie os botões, com a solução Diluent 2 em um frasco de contador de células. Use configurado como quatro e pressione comece a medir o branco com nova solução Diluent 2.
Altere o frasco de cintilação com 100 microliters de suspensão celular em 10 mililitros da solução Diluent 2. Use configurado como quatro e pressione comece a medir as amostras. Observe o número de células por mililitro no display digital, prepare cinco mililitros de cada suspensão celular e misture-os para obter um volume final de 10 mililitros em uma proporção de um para um, usando pipeta repetindo manual para pipetizar 100 microliters da suspensão celular em cada poço da placa inferior U de 96 poços.
Coloque a placa em uma incubadora sob condições padrão de cultura tecidual e verifique se há uma formação de esferoides após 48 horas. Tire fotos deste esferoides a 40 X de ampliação usando um contraste de fase ou microscópio estéreo de fluorescência. Para preparar a cultura de queda de enforcamento misture as suspensões celulares em uma proporção de um para um para obter um volume final de dois mililitros.
Use uma pipeta P20 para ver a mistura celular na forma de 15 gotas de microliter no chumbo invertido de uma placa de Petri de 10 centímetros. Inverta a tampa com as gotas e adicione cinco mililitros de meio base EBM-2 na parte inferior do prato para evitar a evaporação das gotas. Colete aproximadamente 50 esferoides em um tubo de 1,5 mililitro com uma ponta intestinal de uma pipeta de microliter P200.
Deixe-os se acomodarem na parte inferior do tubo pela gravidade e depois descartem o supernatante. Fixar estes esferoides com 500 microliters de 4%PFA por uma hora em temperatura ambiente. Ferva 2% Nobel Algor Solution na PBS usando uma placa quente com uma mexida magnética por três a cinco minutos para dissolver completamente o pó augurous e resfriado até cerca de 60 graus Celsius.
Remova o PFA com uma pipeta P1000, lave este esferoides com 500 microliters de PBS e deixe-os sedimentares. Uma vez instalado descarte o supernatante cuidadosamente pipeta 600 microliters de solução Agora no tubo de 1,5 mililitro com esferoides e coloque o tubo imediatamente em uma centrífuga com um rotor horizontal a 177 vezes G por dois minutos. Adicione uma corda curta no meio da Solução Agro para remover facilmente o plugue do tubo.
Solidificar o plugue Agros no gelo, ou a quatro graus Celsius adicionar 500 microliters de PBS no tubo de 1,5 mililitro para evitar secar a pelota. Adquira imagens de seções esferoides usando um microscópio estéreo. Calcule a quantidade de solução necessária para adicionar 10 microliters por poço de uma mistura de aam de cálcio e homodimers de ethidium diluídos usando EBM-2 em uma proporção de um a 50.
Adicione a mistura de coloração aos esferoides e coloque a placa na incubadora de acordo com o padrão, as condições de cultura tecidual por 30 a 60 minutos. Adquira imagens a 40 X de ampliação usando o microscópio estéreo de fluorescência. Em placas inferiores U, a formação de esferoides foi observada 48 horas após a semeadura de sete células mcf.
No entanto, a formação de eferóides não foi observada no caso de células endoteliais ou células linfáticas. Semear as sete células endoteliais ou mcf sete mais células linfáticas na proporção um para um também resultou na formação de esferoides. O crescimento sequencial dependente do tempo de sete spheroids mcf foi registrado variando de 24 a 120 horas.
O tamanho dos esferoides aumentou de cerca de 100 micrômetros para cerca de 200 micrômetros em cinco dias. Com uma taxa de crescimento aumentada observada nos esferoides tratados com o estimulador de crescimento. A estrutura dos esferoides e a forma de suas células não apresentaram anormalidades após a transfecção com oligonucleotídeos de controle na presença de Lipofectamina.
As células que expressavam seu marcador proliferativo Ki-67 foram distribuídas de forma homogênea nestes esferoides. Cleave para caspase três manchas deste esferoides mostraram células apáticas após quatro dias de cultura. Estudar as células nestes esferoides com CD-31 e Ki-67 revelou que 55% das células são epiteliais 45% são endoteliais e 25% das células estão proliferando.
Para avaliar a porcentagem de células vivas e mortas, os esferoides de quatro dias de idade foram manchados com aam de cálcio e ethidium-homodimer. Um esferoide recém-pensado também mancha para células mortas e vivas revelou que os esferoides são muito sensíveis a condições de congelamento. Ao seguir seu protocolo, certifique-se de que as células saudáveis sejam usadas para misturar afrodite Outra coisa a se lembrar seria evitar danificar essas afrodites durante a tampa dp para obter uma boa seção também garantir o paladar da afrodite antes do polimeriza.
Esse modelo poderia ser melhorado ainda mais com a inclusão de outras células, como fibroblastos envolvidos na progressão do tumor e usá-lo para avaliar a eficácia de agentes terapêuticos visando o crescimento do câncer.
