Este protocolo ajuda a isolar microglia das lesões de desmielinização microdissectadas do cérebro de camundongos adultos para estudar as características microgliais in vivo. Esta técnica economiza tempo e tem requisitos menores para experimentadores e equipamentos. Este método ajuda a isolar a microglia do cérebro do animal, especialmente aqueles tecidos microdissectados em vários estados da doença.
Comece por microdisstar as lesões rotuladas por corante neutro ao redor do caloso corpus sob um estereóscópio. Centrifugar o tecido dissecado a 300 vezes g durante 30 segundos para coletar a amostra na parte inferior do tubo. Enzimeia pré-aqueça uma e enzima misture de 2 a 37 graus Celsius em uma incubadora.
Em seguida, adicione 1.950 microliters de enzima pré-aquecido misture de uma a uma amostra, e digerir em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. Adicione 30 microliters de enzima pré-aquecido misture dois e misture suavemente. Após a digestão, adicione quatro mililitros de PBS frio ao tubo e agite suavemente.
Centrifugar as amostras de tecido a 300 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius, e aspirar o supernante lentamente e completamente. Resuspenque a pelota de célula suavemente com 1.550 microliters de PBS frio. Adicione 450 microliters da solução fria para remoção de detritos e misture-os bem.
Use uma pipeta de 1.000 microliteres para sobrepor a mistura muito lentamente, e suavemente com dois mililitros de PBS frio. Centrifugar a mistura e, em seguida, procurar as três camadas. Use uma pipeta de 1.000 microliteres para aspirar completamente as duas camadas superiores e encher o tubo até cinco mililitros com tampão de carregamento a frio.
Inverta suavemente o tubo três vezes. Em seguida, após centrifugação e aspiração do supernante, resuspengue a pelota celular com 90 microliters de tampão de carga, e adicione 10 microliters de contas CD11b. Misture bem e incubar por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Após a incubação, adicione um mililitro do tampão de carga e lave as células, e tubos suavemente o líquido para cima e para baixo com uma pipeta de 1.000 microliter. Centrifugar as células a 300 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius, e aspirar o supernatante completamente para remover as contas desvinculados. Resuspengue as células em 500 microlitres do tampão de carga, e coloque a coluna MS com seu separador para seleção positiva no campo magnético.
Enxágüe a coluna com 500 microlitres do tampão de carga para proteger as células e garantir a eficiência da classificação magnética com base no protocolo do fabricante. Aplique a suspensão da célula na coluna MS e descarte o fluxo contendo as células não rotuladas. Adicione 500 microliters do tampão de carga para lavar a coluna e remova-a do separador.
Coloque a coluna em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione um mililitro do buffer de carregamento na coluna. Finalmente, empurre o êmbolo para o fundo da coluna para eliminar as células magneticamente rotuladas. Uma representação esquemática da estratégia de gating usada na análise de citometria de fluxo de microglia isolada de lesões de desmielinação de camundongos adultos antes e depois da classificação celular ativada por magnético é mostrada aqui.
As imagens gráficas representam a altura de dispersão dianteira e a altura de dispersão lateral para selecionar células, área de dispersão dianteira e altura de dispersão para a frente para a seleção de células únicas, e CD11b-FITC e CD45-APC para selecionar as células mielóides e microglia. A proporção de microglia aumentou significativamente após a triagem celular ativada por magnético. A imagem gráfica representa a estratégia de gating usada na análise de citometria de fluxo para células individuais vivas e mortas após a triagem celular ativada por magnético.
Aqui, 7-aminoactinomicina D e altura de dispersão lateral foram usados para selecionar as células vivas. Ao tentar este procedimento, lembre-se precisamente de microdissccionar as lesões desmielinizantes sob um estereóscópio baseado nas marcas vermelhas neutras.
