TLW foi apoiado por uma Marie Curie internacionais de entrada Fellowship. Este trabalho também foi financiado por fundos institucional básica, Bundesministerium für Bildung e Forschung (BMBF) financiamento e, em parte, com o apoio do Programa Prioritário de Pesquisa (SFB) 655 para GK. Os autores gostariam de agradecer a Anne Karasinsky para o cuidado e manutenção de todos os animais utilizados neste estudo e Odette Leiter, Susann Ruhwald, Fanny Boehme, e Richard Wetzel para cultura de células e assistência microscopia.

1. Configuração básica e Preparação de Meio de Cultura <ol><li> Pelo menos, dois dias antes do início do ensaio, preparar poli-D-lisina (PDL) / laminina placas revestidas para culturas em monocamada aderente. Para preparar poços / frascos adicionar suficiente PDL (10 mg / ml em dH2O) para revestir a superfície e incuba-se durante a noite à temperatura ambiente. Remover a solução a partir da placa e lavar o prato três vezes com dH2O Deixe secar ao ar. Adicionar laminina (5 mg / ml em DMEM frio: F12) e incubar a 37 ° C durante a noite. Retirar a laminina e usar as placas imediatamente ou armazenar com a laminina, a -20 ° C até ser necessário. </li><li> Prepare fogo pipetas polidas com &quot;médio&quot; e &quot;pequenos&quot; furos girando pipetas Pasteur de vidro em uma chama até que as bordas se tornam arredondadas. Autoclave para esterilizar. </li><li> No dia da dissecção, preparar a quantidade adequada de meio de cultura através da mistura de Meio Basal Neural com 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg / ml de heparina, 50 unidades / mL de Penicilina / Estreptomicina, / factor de 20 ng ml purificada rato receptor grau de crescimento epidérmico (EGF), e 20 ng / factor de crescimento de fibroblastos bovino recombinante ml (FGF-2). Aquecer o meio de cultura a 37 ° C em um banho de água. </li><li> Para a dissociação SVZ, preparar 0,05% de tripsina-EDTA e inibidores de 0,125 mg / ml de tripsina contendo 0,01 mg / ml de ADNasel. Equilibrar as soluções a 37 ° C. </li><li> Configurar um microscópio de dissecação e preparar as ferramentas necessárias para remover o cérebro (tesoura e pequena espátula) e para ZSV e DG dissecções (bisturi, 27 G agulha acoplada a seringa de 1 ml, 1 x # 7 fórceps, 1 x # 5/45 fórceps) por imersão em etanol a 70%. </li></ol> 2. Colheita de cérebros adultos rato e SVZ / DG microdissecações <ol><li> Anestesiar adulto solteiro (8 semanas de idade) ratos de acordo com as diretrizes institucionais apropriados. Realizar deslocamento cervical. </li><li> Pulveriza-se a cabeça com 70% de etanol para esterilizar a área e para minimizar a quantidade de pele que umdHères para as tesouras e cérebro. Usando uma tesoura afiada decapitar o animal na base do tronco cerebral. </li><li> Segurando a cabeça na base do crânio, corte no crânio entre os dois bulbos olfatórios, colocando uma lâmina de um pequeno par de tesouras em cada cavidade ocular e corte coronal. Em seguida, fazer dois cortes laterais na base do crânio, seguido por um corte longitudinal através do crânio, ao longo da sutura sagital Cuidado:. Garantir o ângulo da tesoura é tão superficial quanto possível para evitar danos no cérebro subjacente. </li><li> Exponha o cérebro por trás do crânio descascando ou com a lâmina da tesoura ou um par de fórceps curvos. Livre o cérebro do crânio utilizando uma pequena espátula e coloque em PBS frio. </li><li> Lavar cérebros com PBS para remover sangue e pele. </li><li> Transferir cérebros para um prato de Petri 10 centímetros de plástico contendo PBS </li><li> Coloque placa de Petri contendo o cérebro sob um microscópio de dissecação em baixa ampliação e posicione o brain na sua superfície ventral. Usando pinças curvas finas remover os bulbos olfativos, mantendo o cérebro em posição pelo cerebelo. </li><li> Girar o cérebro para o aspecto dorsal e, usando um bisturi fazer um corte coronal através do cérebro ao nível do quiasma </li><li> Para microdissect o ZSV (para obter instruções mais detalhadas, consulte também Azari et al. 10), coloque a parte rostral do cérebro, de modo que a superfície coronal cortado virado para cima e foco do microscópio para uma maior ampliação. Remova e descarte o septo usando uma pinça curva finas. </li><li> Dissecar a SVZ (a fina camada de tecido em torno do ventrículo) colocando a ponta de uma lâmina de uma par de pinças curvas finas no canto lateral do ventrículo lateral imediatamente sob o corpo caloso e outros cerca de 1 mm para dentro do tecido imediatamente adjacente ao ventrículo. Pressione para baixo a pinça em direção à base do prato e para a face ventral do Ventr.igo para remover uma pequena peça triangular de tecido. Coloque a SVZ dissecados numa caixa de Petri sobre gelo. </li><li> Para microdissect o DG (para obter instruções mais detalhadas, consulte também Hagihara et al. 11), coloque a porção caudal do cérebro na placa de Petri e corte ao longo da fissura longitudinal usando um bisturi. </li><li> Sob um microscópio de dissecção, remover o cerebelo e do diencéfalo utilizando fórceps. </li><li> Reorientar o microscópio para que as bordas ao redor do DG são agora visíveis. Para remover o giro denteado, insira a ponta de uma agulha 27 G e deslizar ao longo da fronteira entre a DG e corno de Ammon. Usando fórceps finos, libertar o DG a partir do tecido circundante. </li></ol> 3. ZSV dissociação Tissue <ol><li> Picar o tecido usando uma lâmina de bisturi para cerca de 1 min até que não há grandes peças permanecem. </li><li> Transferir o tecido moído para um tubo de 15 ml usando 1 ml de pré-aquecida de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar durante 7 min, emum banho de água regulado para 37 ° C. </li><li> Para interromper a reação enzimática, adicionar 1 ml de inibidor de tripsina contendo DNaseI e misturar o conteúdo sacudindo o tubo. </li><li> Pellet da suspensão por centrifugação a 300 xg durante 5 minutos e descarta-se o sobrenadante </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de crescimento e dissociar cuidado pipetando para cima e para baixo de aproximadamente 7-10x com uma pipeta P1000 Cuidado:. Sobre trituração pode levar ao aumento da morte celular e terá um impacto negativo no crescimento celular subseqüente. </li><li> Adicionar meio de crescimento para um volume total de 5 ml e passar a suspensão de células através de uma peneira de 40 milímetros para remover detritos e aglomerados de tecido não dissociada. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e ressuspender o sedimento resultante em 200 ml de meio de crescimento. </li></ol> 4. DG dissociação Tissue <ol><li> Picar o tecido usando uma lâmina de bisturi para cerca de 1 min até que não há grandes peças permanecem e transferênciaem pré-aquecido mistura de enzima papaína (DCP 2,5 U / mL, dispase 1 U / ml, a ADNasel de 250 U / ml). Incubar durante 20 min a 37 ° C, misturando por inversão do tubo a cada 3-5 minutos. </li><li> Dissociar o tecido usando mecanicamente um furo médio, o fogo polido, Pasteur pipeta pipetando cima e para baixo suavemente 10x. </li><li> Incubar durante mais 10 min a 37 ° C, misturando por inversão do tubo a cada 3-5 minutos. </li><li> Além disso dissociar o tecido usando um pequeno furo mecanicamente, fogo polido Pasteur pipeta pipetando cima e para baixo suavemente 10x. </li><li> Centrifugar a 130 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de solução tampão (1x HBSS, glicose 30 mM, HEPES 2 mM (pH 7,4), 26 mM de NaHCO 3). Make up para 10 ml com solução tampão. </li><li> Centrifugar a 130 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 ml de 20% de Percoll. (Para preparar 90% de Percoll, adicionar 4,5 ml de 100% de Percoll para 0,5 ml de PBS 10x, em seguida, dilua ainda mais esta a 20%por adição de 1,1 ml de 90% de Percoll com 3,9 ml de PBS 1x). </li><li> Centrifugar 450 g durante 15 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão. </li><li> Centrifugar a 130 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em 200 ul de meio de crescimento. </li></ol> 5. Geração de culturas aderentes em monocamada <ol><li> Placa SVZ dissociada ou DG tecido numa única PDL / laminina revestido poço de uma placa de 96 poços e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Aproximadamente 24 horas após o plaqueamento, uma vez que as células tenham aderido à superfície revestida, trocar o meio de crescimento para remover o excesso de detritos adicional. </li><li> A cada 3-4 dias subsequentes, a troca de metade do meio de crescimento com meio fresco para repor os factores de crescimento. </li><li> Repita até as células atingirem aproximadamente 80% de confluência e está pronto para ser passado Nota:. Tempo entre revestimento e a primeira passagem podem levar até 2-3 semanas. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. Passaging de culturas aderentes monocamada <ol><li> Quando as culturas atingem cerca de 80% de confluência remover o meio do poço e lava-se com PBS. Nota: Não permitir que as células a ser superior a 90% da confluência como esta pode levar ao desprendimento de células e formação neuroesfera e, além disso, níveis aumentados de morte celular. </li><li> Adicionar 50 ml de Accutase e incubar a 37 ° C durante 2-3 minutos (a verificação para ver se as células são arredondadas e isolada). </li><li> Remover as células para um tubo de 15 ml e lava-se bem a uma vez com PBS e transferir para o mesmo tubo. </li><li> Dilui-se as células para 5 ml com PBS e centrifugar 300 xg durante 5 min. </li><li> Para a primeira passagem, diluir as células a 1 ml e a placa em uma PDL / laminina revestido poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Para passagens subsequentes, ressuspender as células em 200 ml de meio de crescimento e a contagem utilizando um hemocitómetro. Placa de 1 x 10 4 células / cm 2 no poço revestido com tamanho adequado ou balão. </l<html> i&gt; </ol> 7. Diferenciação de culturas aderentes monocamada <ol><li> Para diferenciar as culturas em monocamada, as células aderentes placa proliferar em PDL / Laminin lamelas revestidas a uma densidade de 1 x 10 4 células / cm2 em meio de crescimento contendo 20 ng / mL de EGF e 10 ng / ml de bFGF. </li><li> Quando as células atingem cerca de 80% de confluência (normalmente 2 dias), substituir o meio de crescimento com meio contendo 5 ng / mL de bFGF e 0 ng / mL de EGF. </li><li> Seguindo 2 dias em 5 ng / ml de bFGF, substituir o meio com meio de crescimento na ausência de ambos mitogénios por mais 3 dias Nota:. Durante este período de uma quantidade significativa de morte celular ocorre. </li><li> Depois de um total de 5 dias, lavar as células diferenciadas com PBS para remover as células mortas, em seguida, fixar com 4% de paraformaldeído (PFA), durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar novamente com PBS, para remover qualquer lamelas PFA e armazenar em poços em 1 ml de PBS a 4 ° C. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 8. Neurosphere Cultura e Quantificação <ol><li> Dilui-se a SVZ dissociada ou DG tecido de um animal, em 20 ml de meio de cultura e a placa 200 mL / cavidade em uma placa de 96 cavidades utilizando uma pipeta de 10 ml multidoser. </li><li> Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 6-7 dias para as neuroesferas SVZ derivados e 10-12 dias para neuroesferas DG-derivados. Nota: o crescimento de mais do que estes tempos de incubação recomendadas irá resultar numa proliferação e vai levar a morte celular no centro dos neuroesferas e / ou, de fixação e de diferenciação espontânea. </li><li> Contar e medir o diâmetro dos neurospheres usando um retícula ocular montado um microscópio de luz vertical </li></ol> 9. Passagem das neuroesferas Após os neurospheres primários foram contadas e seu tamanho registrado que pode ser expandida ao longo de várias passagens, começando com um único neurosphere ou uma cultura em massa. <ol><li> Granel expansão cultura neurosphere <ol><li> Para passagem neuroesferas combinados como um volume de cultura, remover o meio contendo as neuroesferas da placa, transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as neuroesferas em 1 ml de pré-aquecida de 0,05% de tripsina-EDTA e incubar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Adicionar um volume igual de inibidor de tripsina contendo ADNasel e misturar bem. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg, remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de meio de crescimento. </li><li> Triturar cima e para baixo cerca de 10x com uma pipeta P1000 dissociar as neurospheres. </li><li> Retirar 10 mL da suspensão de células e mistura com um volume igual de azul de tripano e realizar uma contagem de células vivas utilizando um hemocitómetro. </li><li> Reseed as células a uma densidade de 1 x 10 4 células / cm 2 na cultura de células de tamanho adequado bem ou frasco. </li><li> Incubar a 37 ° Ccom 5% de CO2 até se formarem neuroesferas secundárias. </li></ol></li><li> Expansão neurosphere Único <ol><li> Para passagem de neuroesferas individuais escolher poços que contêm um único neuroesfera e cuidadosamente remover e descartar cerca de 160 ul de meio de crescimento de cada cavidade sem perturbar o neuroesfera. </li><li> Adicionar 100 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a cada poço a ser passadas e incubar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Adicionar 100 ul de inibidor de tripsina contendo DNAseI para parar a reacção. </li><li> Triturar aproximadamente 10 vezes para cima e para baixo com uma pipeta P200 para quebrar o neurosphere. </li><li> Transferir 200 ml contendo o neuroesfera dissociado de um novo poço de uma placa de 24 poços contendo 1,5 mL de meio de crescimento. Incubar a 37 ° C com 5% de CO2 até se formarem neuroesferas secundárias. Nota: para determinar o potencial de longo prazo, uma das propriedades fundamentais de um verdadeiro s neuraiscélula temperatura, neuroesferas devem ser passadas por pelo menos 5-10 passagens. Veja também a literatura sobre a interpretação controversa em parte de tais resultados 12-14. </li></ol></li></ol> 10. Diferenciação das Culturas neurosphere Neurospheres primárias ou subculturas podem ser diferenciados para determinar multipotencialidade. <ol><li> Remover neurospheres em suspensão de sua placa de cultura ou frasco e transferi-los para de 10 cm de plástico placa de Petri. </li><li> Sob um microscópio de dissecção remover aproximadamente 15-20 neuroesferas a partir do meio utilizando uma pipeta de P20 e transferir para uma placa de 24 poços contendo meio de cultura, sem factores de crescimento e uma lamela revestida PDL / laminina. </li><li> Diferenciar em cerca de 7 dias a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Lavar as neuroesferas diferenciadas com PBS para remover as células mortas, em seguida, fixar com PFA a 4% durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar novamente com PBS para retirar quaisquer lamelas PFA e armazenar em poços em 1 ml de PBS a 4 ° C </li></ol> 11. Imunocoloração de Neurosphere e culturas aderentes Nota: Para a coloração com o anticorpo O4 omitir a Triton das etapas de bloqueio e de coloração e lembre-se de usar um anticorpo IgM secundário apropriado. <ol><li> Incubar as lamelas contendo as neuroesferas diferenciadas ou culturas em monocamada aderente na solução (10% soro normal Donkey em PBS contendo 0,2% de Triton X-100) de bloqueio, durante 60 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Incubar em solução de bloqueio fresco contendo primário BIII-tubulina, Map2a + b, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) ou anticorpos O4 durante 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x com PBS. </li><li> Incubar em solução de bloqueio fresco contendo anticorpos secundários conjugados com fluorescência adequados e 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1:5000) durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li&gt; Lavar três vezes com PBS. </li><li> Montar as lamelas em lâminas de microscópio de fluorescência usando montagem médio e ar seco no escuro durante a noite </li><li> Ver e imagem usando um microscópio de fluorescência. </li></ol>

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Neurosci. 5, 89 (2011).</li><li>Parmar, M., Sjoberg, A., Bjorklund, A., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+molecular+identity+of+cells+in+the+adult+subventricular+zone+in+vivo+and+after+expansion+in+vitro.">Phenotypic and molecular identity of cells in the adult subventricular zone in vivo and after expansion in vitro.</a> Mol. Cell Neurosci. 24, 741-752 (2003).</li><li>Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+heterogeneity+demonstrated+by+molecular+phenotyping+of+clonal+neurospheres.">Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14506-14511 (2002).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para o início de culturas precursoras neurais, tanto monocamadas como aderentes e neurospheres, das duas principais regiões neurogênicas do cérebro do rato adulto. Há uma série de pontos importantes que devem ser mantidos em mente ao tentar qualquer um destes sistemas de cultivo in vitro. Em primeiro lugar, a escolha do método de dissociação é muito importante e é dependente do tecido. Nas nossas mãos, 0,05% de tripsina-EDTA é muito eficaz para a dissociação de tecido SVZ, e resulta em um maior número de neuroesferas do que quando se utiliza uma técnica de dissociação à base de papaína. Para a dissociação do DG tecido no entanto, recomendamos uma abordagem baseada na dissociação papaína. Quando se comparam directamente os dois métodos de dissociação em DG tecido, observou-se um rendimento significativamente menor de células viáveis ​​e, aproximadamente, 10 vezes menos neuroesferas quando utilizando tripsina. Esta diferença de dissociação pode ser devida à diferença no Teor de tecidon entre as duas regiões. O tecido compacto do DG é rodeado por uma extensa neurópila e danos extensos de processos celulares podem ocorrer durante a dissociação. Um segundo ponto importante a salientar é que, embora o ensaio neurosphere pode ser útil para fazer declarações quantitativos sobre o número de células precursoras presentes em uma determinada amostra de tecido, alguns cuidados devem, entretanto, ser empregado na interpretação destes números absolutos. Fusão de neurospheres pode ser um importante fator de confusão. Vários estudos têm mostrado que os neurônios são altamente móveis e podem fundir-se, mesmo em que são supostamente as condições dos clonais &#39;7,19. A freqüência neurosphere resultante pode ser muito dependente de fatores, incluindo os componentes de média, o procedimento de dissecção eo processo de dissociação. Mesmo entre os manipuladores experientes alguma variação no número de neuroesferas gerados a partir de amostras supostamente idênticos é evidente (ver Figura 1A.) Mais útil, é uma comparação direta da freqüência precursor entre duas amostras dadas (ou seja, contra o controle tratado ou do tipo selvagem contra o knock-out) manipulados pela mesma pessoa dentro de um único experimento, ao invés de uma declaração quantitativa do total número de células precursoras. Ao decidir qual dos dois métodos de cultura é o mais adequado para uma experiência particular, é importante notar que estes dois sistemas de cultura diferem na homogeneidade dos tipos de células geradas. Em comparação com as culturas em proliferação de células aderentes, as quais mostram um conjunto de células precursoras relativamente homogénea (~ 98% de células são Sox2 +) 20, neuroesferas são mais heterogénea e contêm, assim como proliferação de células precursoras de neurónios, astrócitos e diferenciados, 21,22. É importante que as neuroesferas não são cultivadas por longos períodos entre passagens quanto maior o neuroesfera tornar o mais provável é o de encontrar um tipo de células diferenciadas no seu núcleo. Nós tradicionalmente iniciar aderentes monocamada culturas precursoras neurais a partir do tecido de DG entre 5-8 ratos. Portanto, ao tentar estabelecer as culturas em monocamada aderentes da DG ou ZSV de um único mouse, o maior cuidado deve ser tomado durante o processo de dissociação do tecido, a fim de evitar a morte excessiva de células causada por excesso trituração do tecido, ou tomar estendido períodos de tempo entre a dissecção e etapas finais cultura. Este protocolo descreve, pela primeira vez, a geração de culturas aderentes em monocamada de precursor tanto do SVZ e DG de animais individuais. Existem muitos casos em que a comparação da proliferação e diferenciação de precursores tem de ser feito numa única base animal. Estes incluem a capacidade de comparar diretamente o DG e ZSV de animais individuais usando estatísticas emparelhados e para emparelhar dados de cultura com dados comportamentais ou fisiológicos individuais 9. Culturas animais solteiros também albaixo o uso de animais raros transgênicas, onde um grupo de 5-8 doadores por cultura de correspondência de idade não é possível, assim como animais únicos (por exemplo, cruzes F2 ou animais criados fora) para estudos de associação genética.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In the Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does Figure 1 description in the Results section.
Protocol section 1.1 was changed from:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 mg/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 mg/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
to:
At least two days prior to commencing the experiment, prepare Poly-D-lysine (PDL)/Laminin coated plates for adherent monolayer cultures. To prepare wells/flasks add enough PDL (10 &#181;g/ml in dH2O) to coat the surface and incubate overnight at room temperature. Remove the solution from the dish and wash the dish three times with dH2O. Allow to air dry. Add Laminin (5 &#181;g/ml in cold DMEM:F12) and incubate at 37 &#176;C overnight. Remove the Laminin and either use the plates immediately or store with the Laminin at -20 &#176;C until required.
Protocol section 1.3 was changed from:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 &#181;g/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
to:
On the day of dissection, prepare the appropriate amount of culture medium by mixing Neural Basal Medium with 2% B27, 1x GlutaMAX, 2 mg/ml heparin, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml purified mouse receptor-grade epidermal growth factor (EGF), and 20 ng/ml recombinant bovine fibroblast growth factor (FGF-2). Warm the culture medium to 37 &#176;C in a water bath.
Protocol section 3.6 was changed from:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 mm sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
to:
Add growth medium to a total volume of 5 ml and pass the cell suspension through a 40 &#181;m sieve to remove debris and undissociated tissue clumps.
Protocol section 3.7 was changed from:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 ml growth medium.
to:
Centrifuge at 300 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the resulting pellet in 200 &#181;l growth medium.
Protocol section 6.2 was changed from:
Add 50 ml Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
to:
Add 50 &#181;l Accutase and incubate at 37 &#176;C for 2-3 min (checking to see if the cells are rounded and detached).
Protocol section 6.6 was changed from:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 ml growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
to:
For subsequent passages, resuspend cells in 200 &#181;l growth medium and count using a hemocytometer. Plate at 1 x 104 cells/cm2 in the appropriate sized coated well or flask.
Protocol section 8.1 was changed from:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 ml/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
to:
Dilute the dissociated SVZ or DG tissue from one animal in 20 ml of culture medium and plate 200 &#181;l/well across a 96-well plate using a 10 ml multidoser pipette.
Protocol section 9.1.6 was changed from:
Remove 10 ml of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
to:
Remove 10 &#181;l of the cell suspension and mix with an equal volume of trypan blue and perform a live cell count using a hemocytometer.
Protocol section 9.2.2 was changed from:
Add 100 ml of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
to:
Add 100 &#181;l of 0.05% Trypsin-EDTA to each well to be passaged and incubate at room temperature for 3 min.
Protocol section 9.2.5 was changed from:
Transfer the 200 ml containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
to:
Transfer the 200 &#181;l containing the dissociated neurosphere to a new well of a 24-well plate containing 1.5 ml of growth medium. Incubate at 37 &#176;C with 5% CO2 until secondary neurospheres form.
Figure 1 description was updated from:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 mm.
to:
Figure 1. Adult mouse precursor cells can be cultured as adherent monolayer cultures (A) or as neurospheres (B: SVZ, C: DG). Scale bar is 50 &#181;m.

A correction was made to <a href="/video/51225">One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice</a>. Many micro symbols were changed into milli symbols by accident: In Protocols, sections 1.1, 1.3, 3.6, 3.7, 6.2, 6.6, 8.1, 9.1.6, 9.2.2, and 9.2.5 need to be fixed, as does the Figure 1 description in Results.

Erratum: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

O ensaio neurosphere 1,2 ea cultura em monocamada aderente 3,4, ambos desenvolvidos no início de 1990, continuam sendo o padrão ouro em ensaios de células-tronco neurais in vitro. Nestes ensaios, o tecido primário é micro dissecados a partir de uma região particular do cérebro, dissociadas numa suspensão de células isoladas e cultivadas na presença do factor de mitogénios crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos-2 (FGF2) para formar ou flutuante clusters (neuroesferas) ou monocamadas aderentes. Ambos os sistemas têm deve ser dada uma série de vantagens e desvantagens e uma consideração cuidadosa para a questão que deve ser abordada antes de um ou outro sistema é escolhido. Neurospheres permitir que uma simples leitura de diferenças no número de células precursoras e potencial. Além disso, neuroesferas são também uma ferramenta útil para o estudo especificação intrínseca das células quando removidas do seu ambiente externo normal. Extrinpistas sic pode ser estudado pela simples adição do factor de interesse para o meio de crescimento e quantificação do número e tamanho das neuroesferas gerados. A principal desvantagem de neuroesferas no entanto, é que eles formam o seu próprio nicho, com as células no centro das neuroesferas (particularmente grandes neuroesferas) sendo mais diferenciadas do que as da superfície 5. As neuroesferas conter uma mistura de células estaminais, células progenitoras comprometidas, e de células diferenciadas e as interacções célula-célula dentro das neuroesferas neutralizam a manutenção das células estaminais. É por isso que neuroesferas conter apenas um pequeno número de células estaminais verdadeiros 6-8. Culturas de monocamadas aderentes também proporcionar um bom sistema in vitro para o modelo de proliferação in vivo. Culturas aderentes, em que as células permanecem mais isolado e homogêneo, pode eliminar a natureza heterogênea do neurosphere. Sob essas condições de crescimento as células precursoras proliferam rapiDivina e quase todas as células se dividem e expressar as características marcadores precursoras neurais Nestin, Sox2 e BLBP. A desvantagem principal do sistema de cultura em monocamada em comparação com o ensaio de neuroesfera é que os clones derivados de precursores individuais são incapazes de ser monitorizada e quantificado. Um inconveniente da maior parte dos protocolos para ambos os tipos de culturas tem sido a necessidade de usar um número relativamente grande de animais, porque o rendimento das estratégias de isolamento tem sido muitas vezes pobres. Ao mesmo tempo, tornou-se claro que a neurogénese adulta contribui para a individualização do cérebro 9, o que resulta na necessidade de individualizadas modelos ex vivo bem. Estas necessidades podem ser satisfeitas por protocolos &quot;de um rato e um de cultura&quot;, conforme descrito neste relatório. O seguinte protocolo visuais descreve a produção simultânea de culturas precursoras neurais tanto do SVZ e DG de animais individuais ou m como aderenteonolayers ou como neuroesferas. A geração de culturas de animais individuais é particularmente útil quando são necessárias comparações entre animais tratados individualmente ou vários transgênico indivíduo ou camundongos selvagens. Este protocolo inclui instruções detalhadas para a microdissecção simultânea das regiões SVZ e DG de camundongos adultos, a sua dissociação em uma suspensão única célula, o cultivo in vitro tanto como culturas em monocamada aderentes ou neurospheres e análise de multipotencialidade e potencial a longo prazo, os dois cardeal propriedades de uma célula-tronco fide óssea.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">poly-D-lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7280-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">laminin</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11243217001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">glass pastuer pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Volac</td>
			<td style="width:119px;">BS5732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DMEM:F12 (1:1) 1X</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21331-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Neural Basal Medium (1X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">B27 supplements (50X)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glutamax</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Heparain</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Penacillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">bFGF</td>
			<td style="width:179px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">DNaseI</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Accutase</td>
			<td style="width:179px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Papain</td>
			<td style="width:179px;">Worthington</td>
			<td>LS003120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dispase</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Percoll</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HBSS (with Calcium &#38; Magnesium)</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Glucose</td>
			<td style="width:179px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">X997.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">HEPES</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">K39347429847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">1mL syringes&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">2016-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">27 Gauge needles</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">4657705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scalpels (#22 disposable)</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">BA222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont #7 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11271-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Dumont 5/45 forceps</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">scissors</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Iris spatula</td>
			<td style="width:179px;">FST&#160;</td>
			<td style="width:119px;">10093-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PBS</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">flasks/well plates</td>
			<td style="width:179px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">PFA (4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:179px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">trypan blue (0.4%)</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">NDS</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse monoclonal bIII-tubulin antibody</td>
			<td style="width:179px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G712A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit polyclonal glial fibrillary acidic protein antibody</td>
			<td style="width:179px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">20334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">O4&#160;</td>
			<td style="width:179px;">R &#38; D systems</td>
			<td style="width:119px;">MAB1326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Map2a+b</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">donkey anti-mouse Cy3 antibody&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:119px;">715-505-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey anti-rabbit Alexa488&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Dianova</td>
			<td style="width:119px;">711-545-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Aqua Polymount</td>
			<td style="width:179px;">Polysciences Inc</td>
			<td style="width:119px;">18606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">10 ml Combi tips</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">30089677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">plastic 10ml and 25mL serological pipettes</td>
			<td style="width:179px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">4488/4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">Pipetboy</td>
			<td style="width:179px;">Integra biosciences</td>
			<td style="width:119px;">521942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">multidoser pipette</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C waterbath</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">dissecting microscope</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">37C:5%Co2 incubator</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:299px;">centrifuge</td>
			<td style="width:179px;">eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice

O ensaio neuroesfera e do sistema de cultura em monocamada aderente são ferramentas valiosas para determinar o potencial de (a proliferação ou a diferenciação) de células estaminais neuronais adultas in vitro. Estes ensaios podem ser utilizados para comparar o potencial precursor de células isoladas a partir de animais geneticamente diferentes ou tratados diferencialmente para determinar os efeitos de factores exógenos sobre a proliferação e diferenciação de células precursoras neurais e para gerar linhas de células precursoras neuronais que podem ser testadas durante passagens contínuas. O ensaio neuroesfera é tradicionalmente usado para a identificação de post-hoc de células estaminais, principalmente devido à ausência de marcadores definitivos com a qual eles podem ser isolados a partir de tecido primário e tem a grande vantagem de fornecer uma estimativa rápida de números de células de precursor no tecido cerebral derivados de animais individuais. Culturas de monocamadas aderentes, em contraste, não são tradicionalmente utilizadas para comparar a proliferação entre animais individuais, Como cada cultura é geralmente iniciada a partir do tecido combinado de entre 5-8 animais. No entanto, têm a grande vantagem de que, ao contrário de neuroesferas, que consiste de uma população homogénea principalmente de células precursoras e são úteis para seguir o processo de diferenciação em células individuais. Aqui, nós descrevemos, em detalhe, a geração de culturas de neuroesferas e, pela primeira vez, culturas aderentes de animais individuais. Isto tem muitas consequências importantes, incluindo a análise emparelhada da proliferação e / ou diferenciação potencial, tanto na zona subventricular (SVZ) e giro dentado (DG) de linhas de ratinhos tratados ou geneticamente diferentes, bem como uma redução significativa no uso de animais.

Embora as duas regiões de origem neural do cérebro do rato adulto contêm células precursoras neurais, estas células podem comportar-se de maneira muito diferente quando cultivadas in vitro. As culturas em monocamada aderente gerados a partir de ambas as regiões parecem morfologicamente indistinguíveis (Figura 1A), no entanto, as culturas aderentes SVZ derivados proliferar mais rapidamente e necessitam de ser passadas, em média, 1-2 dias mais cedo do que os que são derivados a partir do DG. Tal como neuroesferas, as células precursoras derivadas da SVZ também proliferam mais rapidamente e formam neuroesferas maiores (Figura 1B) do que as células precursoras derivadas de DG (Figura 1C). Embora neuroesferas SVZ derivados são geralmente contados após 6-7 dias em cultura, neuroesferas DG-derivados são geralmente quantificados após 10-12 dias. Além disso, um número muito maior de células precursoras neurais residir no SVZ comparação com o DG, como evidenciado pela quase 10 vezes maior número de neuroesferas, que podem ser génerosted a partir desta região (SVZ: 1,173 ± 74,9 vs DG: 145,3 ± 26,4, p = &lt;0,0001, n = 10 animais por grupo, figura 2A). Estudos têm demonstrado que as células precursoras dentro do SVZ e DG responder a diferentes estímulos. As células precursoras do DG são ativados por tipos específicos de aprendizagem espacial e por estímulos como o enriquecimento ambiental e atividade física, ao passo que as células precursoras SVZ são ativados por aprendizado olfativo e enriquecimento olfativo. Coerente com isso, um de nós (TLW) previamente demonstrado que a DG contém uma população de células-tronco latentes e as células progenitoras que podem ser ativadas por excitação neural 15-18. Em contraste, verificou-se que as células precursoras de SVZ respondem de maneira muito diferente a este estímulo, com uma diminuição no número neuroesfera em resposta à despolarização níveis de KCl 17. Aqui, temos repetido esta experiência, chapeamento de metade das células isoladas derivadas da SVZ e DG da individual animais em despolarização níveis de KCl e a outra metade dos níveis de controlo de KCl. Demonstramos, como anteriormente, enquanto que as células precursoras DG são activados por despolarização (101,2 ± 17,4 versus 184,8 ± 12,5, p = 0,005, n = 5 animais), a proliferação de células derivadas da SVZ é, de facto, diminuiu significativamente ( 368,0 ± 62,9 vs 266,6 ± 41,6, p = 0,02, n = 5 animais; figura 2B). Para confirmar o potencial a longo prazo, uma das características fundamentais de uma célula estaminal verdade, neuroesferas individuais ou as culturas de monocamadas aderentes deverá ser capaz de expansão ou seja estendido ao longo de pelo menos 10 passagens. Em cada passagem, a seguir a preparação de uma suspensão de células individuais, o número de células é contado e a expansão de dobragem é calculado. O total de células teórica é então calculada multiplicando a expansão vezes durante esta passagem pelo total teórica da passagem anterior. Este é disp<html> Definiu como um gráfico de linhas, com o número de passagem plotada contra o log10 do número total de células teórico (ver exemplo Figura 3). Para confirmar multipotencialidade, ambas as culturas de monocamada e neuroesferas podem ser diferenciadas pela retirada mitogénio e ser mostrado para dar origem a ambos os neurónios e células da glia (Figura 4). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig1.jpg" /> Figura 1. Adulto células precursoras do rato podem ser cultivadas como culturas em monocamada aderentes (A) ou como neurospheres (B: ZSV, C: DG).. Barra de escala é de 50 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> load/51225/51225fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51225/51225fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Significativamente mais neuroesferas são gerados a partir do SVZ comparação com o DG de ratinhos única (A). As células precursoras de SVZ e DG respondem diferentemente a despolarização in vitro (B). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig3.jpg" /> Figura 3. Para confirmar a potenciação a longo prazo, neuroesferas são expandidas para mais de 10 passagens. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51225/51225fig4.jpg" /> Figura 4. Neuroesferas podem ser diferenciados em BIII-tubuneurônios lin + (A: vermelho), GFAP + astrócitos (A: verde), O4 + oligodendrócitos (B: vermelho) e Map2ab + neurônios (C: vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51225/51225fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a>

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One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

one-mouse-two-cultures-isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

37.2K visualizações.  Technische Universität Dresden.  Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais. 

Vídeo: One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Neurociência

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Isolamento e Cultura de células da crista neural-tronco de folículos capilares humanos

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Seleção de células-tronco neurais de células progenitoras e do rato adulto subventricular Zone e Live-imagem de seus Dynamics com o ciclo celular

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

Excitação externa de Neurônios Usando Campos Elétricos e Magnéticos em One e culturas bidimensionais

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...