Este protocolo descreve uma técnica de plataforma para isolar células endoteliais microvasculares dos músculos esqueléticos. Essas células podem ser usadas, por exemplo, para obter mais insights sobre as funções da barreira muscular sanguínea. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que é possível isolar células endoteliais microvasculares primárias com alta pureza.
Essa técnica pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de doenças musculares imunomu medianas, como a interação entre células musculares e endoteliais na saúde e na doença. Primeiro, prepare todas as soluções necessárias e placas de seis poços, conforme descrito no protocolo. Para iniciar o procedimento prático, obtenha um par de tesouras cirúrgicas afiadas/contundentes, um par de tesouras cirúrgicas afiadas/afiadas e fórceps retos e curvados.
Desinfetar todos os instrumentos cirúrgicos com 70% de etanol. Posicione um rato macho adulto eutanizado nas costas e umedeça as pernas com 70% de etanol. Usando a tesoura cirúrgica afiada/contundente, corte cada perna inteira cortando a articulação do quadril.
Coloque as extremidades em um prato de cultura celular fechada. Transfira o prato para um capô de fluxo laminar estéril. Use tesoura afiada e fórceps curvos para cortar a pele aberta do quadril até a ponta do dedo do dedo do dedo.
Use os fórceps retos para segurar o dedo do pé ou a almofada do pé enquanto usa as fórceps curvas para descascar a pele do dedo do pé para o quadril. Para isolar o quadríceps musculus femoris, corte o tendão do joelho e corte o músculo ao longo do fêmur até o quadril. Corte o tendão de Aquiles para isolar o musculos tríceps surae.
Em seguida, corte ao longo da tíbia para a fossa popliteal e remova o músculo. Para remover tendões que não podem ser dissociados, segure os músculos com os fórceps curvos e corte cada tendão apropriado. Adicione 2.445 microliters de solução de digestão preparada a um prato de cultura celular fresco e rotulado e determine o peso.
Transfira todas as peças musculares para este prato. Então, determine o peso. A diferença de ambos os valores medidos proporciona o peso seco do tecido muscular que não deve exceder um grama.
Usando a tesoura afiada cirúrgica, corte todo o tecido muscular em pequenos pedaços. Incubar a suspensão do tecido a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por 1,5 horas, certificando-se de misturar a suspensão cuidadosamente com uma seringa de insulina de um mililitro a cada 20 minutos por aproximadamente cinco minutos. Após a incubação, transfira a suspensão para um filtro de nylon de 70 micrômetros colocado em um tubo rotulado de 50 mililitros e colete o fluxo através.
Lave o coador de células com oito mililitros de DMEM e colete o fluxo através. Se as peças estiverem conectando o coador, resuspense a solução dissociada. Descarte o coador de células e centrifugar a suspensão a 300 vezes a gravidade e a 20 graus Celsius por 10 minutos.
Remova cuidadosamente o supernascer e resuspense a pelota de célula em um mililitro de um tampão de potássio de cloreto de amônio para a lise dos glóbulos vermelhos. Incubar em temperatura ambiente por 30 segundos. Em seguida, adicione nove mililitros de DMEM contendo 10% de FCS para parar a reação.
Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, use uma câmara de contagem de células Neubauer para determinar os números das células. Para começar a esgotar as células CD45 positivas, centrifugar a suspensão a 300 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Remova o supernatante completamente e resuspenja a pelota da célula em 90 microliters de buffer MCS. Adicione 10 microliters de microesferas CD45 e misture a suspensão. Incubar em uma geladeira a quatro a oito graus Celsius por 15 minutos.
Depois disso, adicione um mililitro de buffer MCS. Centrífuga a 300 vezes a gravidade e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernatante completamente e resuspenja as células em 500 microliters de buffer MCS.
Posicione uma grande coluna magnética no campo magnético do separador. Enxágüe o reservatório da coluna com três mililitros de tampão MCS. Em seguida, coloque um tubo cônico de 15 mililitros abaixo da coluna para coletar o fluxo através.
Aplique toda a suspensão celular na coluna e deixe-a fluir completamente. Lave a coluna três vezes adicionando três mililitros de tampão MCS no reservatório para cada etapa de lavagem e esperando até que o reservatório da coluna esteja vazio antes de iniciar a próxima etapa de lavagem. Colete as células não rotuladas que passam pela coluna para uso em outras etapas de separação.
Para começar a acumular células CD31 positivas, use uma câmara de contagem de células Neubauer para determinar os números de células. Depois, centrifugar as células sem rótulo a 300 vezes a gravidade e a 4 graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernatante completamente e resuspenja a pelota em 90 microliters de buffer MCS.
Adicione 10 microliters de microesferas CD31 e misture toda a suspensão. Incubar em uma geladeira a quatro a oito graus Celsius por 15 minutos. Depois disso, adicione um mililitro de tampão MCS e centrífuga a 300 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Remova o supernatante e resuspenja as células em 500 microliters de buffer MCS. Posicione a coluna magnética média no campo magnético do separador. Enxágüe a coluna com 500 microliters de buffer MCS.
Em seguida, coloque um tubo cônico de 15 mililitros abaixo da coluna para coletar o fluxo através. Aplique toda a suspensão celular na coluna e deixe fluir completamente. Lave a coluna três vezes adicionando 500 microliters de tampão MCS no reservatório para cada etapa de lavagem, e espere até que o reservatório da coluna esteja vazio antes de iniciar a próxima etapa de lavagem.
As células sem rótulo que passam pela coluna representam a fração CD31-negativo cd31-negativo. Armazená-los para mais controles de qualidade. Em seguida, retire a coluna do separador e coloque-a em um tubo de coleta adequado.
Pipeta dois mililitros de tampão MCS na coluna. Empurre imediatamente o êmbolo para dentro da coluna para lavar as células magneticamente rotuladas. Esta fração CD45-negativa, CD31-positive representa as ECs murinas primárias enriquecidas.
Centrifugar a suspensão celular a 350 vezes a gravidade e a 20 graus Celsius por cinco minutos. Remova o supernatante completamente e resuspenque as células em um mililitro de meio celular endotelial. Transfira as células para um único poço de uma placa de cultura revestida de seis poços contendo um mililitro de meio celular endotelial.
Para o cultivo, incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma incubadora estéril, certificando-se de refrescar o meio a cada dois ou três dias. Quando as células estiverem em confluência de 80 a 90%, enxágue cada poço contendo células duas vezes com dois mililitros de PBS em duas etapas de lavagem consecutivas. Em seguida, adicione 800 microliters de solução EDTA de trippsina a cada poço e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em uma incubadora estéril por três a cinco minutos.
Depois disso, adicione 1.200 microliters de DMEM contendo pelo menos 10% de FCS para parar a atividade enzimática. Centrífuga a 350 vezes a gravidade e a 20 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, acumule as células CD31 como descrito anteriormente para aumentar a pureza.
Use um microscópio de contrato de campo brilhante ou fase padrão com ampliação de 20% e abertura numérica de 0,35 lentes para observar a confluência celular. Neste estudo, as células endoteliais microvasculares do músculo esquelético primário são isoladas. Um dia após o isolamento, mmecs murine primários e outras células residuais formam conglomerados e aderem ao fundo dos pratos culturais.
A partir do sétimo dia, podem ser observadas células planas e alongadas, no entanto, a contaminação de outras células esferoides ainda é visível. Assim, é necessário outro ciclo de seleção cd31-positiva via MCS. A partir de agora, os MMECs murinos primários proliferam a uma densidade de aproximadamente 80 a 90% Após a confluência, eles normalmente formam uma monocamada não sobreposta de células longitudinaismente alinhadas.
A proliferação pára na confluência devido à inibição do contato. O controle de qualidade via citometria de fluxo mostra valores para viabilidade e pureza que variam em torno de 70% cada para células imediatamente após o isolamento. As células cultivadas após outra seleção de CD31 positivo via MCS mostram valores satisfatórios para a pureza, bem como para a viabilidade, variando até 95% cada.
As células obtidas são então investigadas para a expressão genética dos genes marcadores de células de satélite muscular emparelhados proteína caixa 7 e M-cadherin no nível mRNA por PCR quantitativo. Como esperado, apenas a fração CD45-negativa, CD31-negativo, bem como as células musculares murinas primárias diferenciadas expressas proteína da caixa 7 e M-cadherin, enquanto CD45-negativo, CD31-positivo e os MMECs murine primários são negativos para esses marcadores. Após a segunda etapa do CD31 MCS, o qPCR é usado para avaliar a expressão de proteínas de junção apertadas em MMECs murinas primárias confluentes.
Os MMECs murine primários são vistos para expressar altos níveis de claudin-5, occludin e zonula occludens-1, enquanto o PMMC apenas mostra uma baixa expressão de oclludens de zonula-1. Esta técnica pode ser realizada em cinco a seis horas. Seguindo este protocolo, outros métodos, como ensaios migratórios ou experimentos de estresse de baixa tesoura podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de isolar células endoteliais microvasculares primárias dos músculos esqueléticos por dissociação mecânica e enzimática e classificação de células magnéticas.
