Este trabalho foi apoiado pelo Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), células em movimento Cluster de Excelência (EXC 1003 - CIM), da Universidade de Muenster (a SB e SGM) e pela Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 a SB e SGM). Agradecemos Heike Blum pelas excelentes ilustrações.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelas autoridades locais (&quot;LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, tierschutz; Recklinghausen, Alemanha&quot;) e realizada de acordo com a lei alemã de proteção animal. 1. Comentários gerais para rato Experimentos <ol><li> Realizar todos os experimentos com ratos, de acordo com as diretrizes do respectivo Comitê Institucional Animal Care e Uso. </li><li> Mantenha os ratos sob condições livres de patógenos e capacitá-los a ter acesso a alimentos e água ad libitum. </li><li> Use ratos da mesma idade e sexo em grupos experimentais porque as propriedades biológicas podem variar de acordo com idade e sexo. </li><li> Sempre que possível tentar reduzir, aperfeiçoar ou substituir experiências com animais. </li></ol> 2. Preparação do gradiente de Percoll <ol><li> Misturar 19 ml de 1x PBS com 1 ml de PBS 10x, 1 ml de FCS e 10 ml de Percoll. </li><li> Realize sterile filtração em um tubo de vidro (diâmetro de poros do filtro: 0,2 um). Depois armazenar a solução a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparação de Meio endotélio celular e revestimento de placas de cultura celular <ol><li> Médio de células endoteliais: <ol><li> Preparação de 500 ml de meio de: (. Aprox 20%) Misturar 400 mL de meio DMEM (aprox. 80%) com 100 ml PDS, 0,25 ml de bFGF (. 20 ug / ml; aproximadamente 0,05%), 0,5 ml de heparina (100 ul / ml; aprox. 0,1%) e 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml; aprox. 0,1%). Adicionar pyrumycin apenas por meio de cultura de células usados ​​nos primeiros 2 dias de cultura. </li><li> Efectuar a filtração estéril num tubo de vidro (diâmetro dos poros do filtro: 0,2 um). Depois armazenar a solução a 4 ° C. </li></ol></li><li> Revestimento de placas de cultura de célula: <ol><li> Para obter 1 ml de solução de revestimento, se preparar uma solução de 500 ul ddH2O, 400 ul de colagénio IV (0,4 mg / ml) e 100 ul de fibronectina (0,1 mg / ml). </li><li> Cubra toda a superfície do each poço da placa de cultura de células com a solução de revestimento. Armazenar a placa a 4 ° C durante a noite. </li></ol></li></ol> 4. Isolamento de células endoteliais microvasculares de Murino Cérebro (MBMEC) <ol><li> Sacrifício 10 ratinhos adultos (8-12 semanas de idade, C57BL / 6) por deslocamento cervical. Depois isolar os tapetes do cérebro e loja em 5 ml de PBS (Ressalva: Trabalho estéril). </li><li> Remover cérebro caules, cerebelo e tálamo com uma pinça. Retire meninges com cuidado rolando os cérebros em um papel mata-borrão estéril. Recolha os resultantes prosencï¿½alos meninges-livres. </li><li> Transferir os cérebros para um tubo Falcon de 50 ml cheia com 13,5 ml de DMEM. </li><li> Picar o tecido, primeiro com uma pipeta de 25 ml, em seguida, com uma pipeta de 10 mL até os meios de comunicação torna-se leitosa. </li><li> Em seguida, digerir o tecido com uma mistura de 0,6 ml de colagenase CLS2 (10 mg / ml em DMEM) e 0,2 ml de DNAse (1 mg / ml em PBS) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) durante 1 hora a 37 ° C em um orbital tremerr a 180 rpm. </li><li> Adicionar 10 ml de DMEM adicionado à suspensão de tecido e centrifugar as células a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante (Ressalva: PELLET é fácil perder) </li><li> Para remover a mielina, ressuspender o sedimento com uma pipeta de 25 ml em 25 ml de DMEM-BSA (20% w / v) (aprox. 25 vezes), e centrifugar a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Descarte a camada de mielina superior (leitoso), com uma pipeta de Pasteur de vidro quebrado com diâmetro maior, e, em seguida, descartar a camada de BSA com uma pipeta Pasteur normal. </li><li> Ressuspender o sedimento em 9 ml de DMEM e adicionar 1 ml de colagenase / dispase (concentração final é de 1 mg / ml) e 0,1 ml de DNAse. Digerir a solução durante 1 hora a 37 ° C num agitador orbital a 180 rpm (ressalva: não utilize a pipeta para ressuspender - células podem ser perdidos). </li><li> Durante a digestão, centrifugar a solução de Percoll para definir-se o gradiente de densidade usando uma ultracentrífuga a 3.000 xg durante 1 hora a 4 ° C, com aceleração, wifreio thout. </li><li> Adicionar 10 ml de DMEM para a suspensão de células digerido. Centrifugar a suspensão a 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 2 ml de DMEM. </li><li> Adicionar as células ressuspensas cuidadosamente no topo do gradiente de Percoll e centrifugar a 700 xg durante 10 min a 4 ° C sem aceleração e de travagem. Nota: As células são visíveis como uma nuvem na interfase. </li><li> Tome aprox. 12 ml da interfase com células com uma agulha estéril de comprimento e colocá-lo em um novo Falcon de 50 ml com 5 ml de DMEM. </li><li> Centrifuga-se as células novamente em 1000 xg durante 10 min a 4 ° C. Em seguida ressuspender o sedimento em meio de células endoteliais (use aprox. 0,2 ml de meio por 1 cm2 de superfície de placa de cultura celular). </li><li> Remover solução de revestimento de placas de cultura de células revestidas (veja o passo 3.2) e enxaguar bem com todos os PBS estéril em duas etapas de lavagem consecutivos. </li><li> Manter em culturas de células endoteliaismeio celular a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador estéril. Alterar o médio a cada 2-3 dias. Dividir células a 90% de confluência. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Disfunção hematoencefálica-barreira é uma característica de várias doenças deletérios do SNC, por exemplo, uma repartição do BBB na esclerose múltipla extensivamente facilita a invasão do SNC por células imunes auto-reativas e permite o encontro ea destruição de oligodendrócitos. No AVC isquêmico o rompimento do BBB e subsequente formação de edema cerebral são fatores críticos que influenciam o crescimento do infarto secundário ea sobrevida global dos pacientes 6. Além disso, por alterações da certificação em áreas remotas lesões isquémicas focais são capazes de induzir alterações funcionais generalizados do cérebro. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes são desconhecidos 5. Em contraste, a alta densidade e de diversidade de transportadores de efluxo em BMECs funcionais reduz a concentração de fármacos benéficos, tais como quimioterapêuticos para malignidades do cérebro ou antibióticos para doenças infecciosas. Portanto, uma compreensão mais profunda do cérebro-sangue-barrier função sob condições fisiológicas e fisiopatológicas é necessária para desenvolver agentes farmacológicos que são capazes de regular especificamente a função de barreira na direcção favorecida 21. Confiável em modelos in vitro do BBB são ferramentas indispensáveis ​​para o estudo dos mecanismos de regulação do BBB. Muitas linhas de células endoteliais do cérebro imortalizados foram estabelecidos e utilizados como modelos in vitro do BBB 22. Estas linhas celulares oferecem certas vantagens sobre BMECs primários à medida que crescem mais rápido e manter certas características do BBB sobre diversas passagens. No entanto, as linhas de células endoteliais não pode substituir totalmente para células primárias como propriedades importantes são alterados que se misturam com a transferibilidade dos resultados experimentais para a situação in vivo. Por exemplo, a linha de células endoteliais de cérebro de murídeo bEnd.5 expressa apenas baixos níveis de proteínas de junções apertadas distribuídos descontinuamente que conduzem a alta pAraCpermeabilidade ellular 23. BEnd.3, outra linha de células endoteliais do cérebro murino frequentemente utilizado, demonstra junções densas e contínuas distribuídas apertados, uma alta resistência transendotelial, vários transportadores de efluxo e baixa permeabilidade paracelular. No entanto, as camadas de células em comparação com bEnd.3 BMECs primárias não possuem uma verdadeira discriminação no que diz respeito à permeação de certos substratos e transcelular paracelulares 24. Em preparações de culturas de células primárias, células contaminantes pode interferir significativamente com a validade dos resultados experimentais. No protocolo descrito, pyrumicin é usado como um agente selectivo para as células endoteliais para alcançar uma elevada pureza. No entanto, um controlo de qualidade regular da cultura de células é inevitavelmente necessário para garantir para experiências fiáveis. Existem vários métodos para o controlo de qualidade, além de propriedades morfológicas típicas de células endoteliais (ver Figura 1A), o transendothelial resistência pode ser medida, ou a expressão do marcador de célula endotelial, tais como CD31 (ver Figura 1B) ou factor de von Willebrand (vWF) pode ser avaliada. O número de células endoteliais cerebrais isoladas a partir de um cérebro de ratinho é relativamente baixo e para estabelecer uma cultura de células adequada para várias experiências, os cérebros dos vários ratos têm de ser reunidas. Na nossa experiência, no mínimo, 10 ratinhos necessitam de ser usado para um ensaio que pode ser um factor limitante, dependendo dos recursos da respectiva instalação para animais. Para evitar viés ou fatores de confusão, apenas camundongos com um fundo genético e ambiental idêntico deve ser agrupadas. Em contraste, bovina e preparações de células endoteliais de cérebro de suíno proporcionar um grande número de células endoteliais do cérebro disponíveis em um cérebro. No entanto, além da criação de simples e de habitação, o repertório amplo e cada vez maior de camundongos transgênicos disponíveis torna murino primário BMECs como um idealmodelo para estudar a função do sangue-cérebro-barreira. Várias descobertas-chave sobre as funções do BBB e os mecanismos moleculares subjacentes vieram de estudos em sistemas de cultura de tecidos em 2D. Recentemente, sistemas de cultura têm sido desenvolvidos 3D 25, onde as células endoteliais são colocados dentro de uma matriz de colagénio o que lhes permite formar lúmen e redes tubulares. Estes novos sistemas de cultura de células para permitir uma reprodução mais precisa dos processos vasculares no organismo intacto in vivo. O envolvimento de outras células dos NVU em 3D sistemas de cultura de células, tais como pericitos e astrócitos pode revolucionar a estudar in vitro da função sangue-cérebro-barreira; primeiros modelos foram desenvolvidos recentemente 26. Há algumas recomendações para a solução de problemas. Em primeiro lugar de trabalho estéril é essencial para a qualidade da cultura de células endoteliais. Em segundo lugar, pyrumycin só deve ser adicionado para celularmeio de cultura utilizado nos primeiros 2 dias de cultura, mais aplicação pode conduzir a um aumento da morte celular e MBMEC função de barreira baixa qualidade. Em terceiro lugar, as enzimas aplicadas neste protocolo deve ser utilizado e armazenado de acordo com as instruções do fabricante; caso contrário, sua função adequada pode ser comprometida. Além disso, o revestimento de placas de cultura de células pode ser alterado se as células endoteliais não atribuem. As concentrações de fibronectina e colagénio pode ser alterada ou outras proteínas de matriz pode ser adicionado à solução de revestimento. Por último, idade, sexo, estação do ano e condições ambientais dentro das instalações dos animais, são fatores importantes que podem influenciar a qualidade de MBMEC isolamento ea comparabilidade dos experimentos. Deve assegurar-se que as condições são comparáveis ​​entre experimentos independentes. O protocolo descrito deve ser considerado como um método básico para isolar neuroimunológicos BMECs murino. As células isoladas podem ser used para uma ampla variedade de aplicações para obter mais conhecimentos sobre a função BBB, tais como ensaios de migração, gene e estudos de expressão de proteínas, eletrofisiológica ou experimentos de permeabilidade. Como mencionado acima, 3D sistemas de cultura de células de BMECs pode proporcionar novas oportunidades para estudar os complexos mecanismos envolvidos na regulação da certificação no âmbito do NVU. Por isso, o isolamento de células endoteliais primárias permanecerá uma técnica valiosa no campo da investigação certificação no futuro.

<html> Microvascular cerebral células endoteliais (BMEC) formam monocamadas, que são parte integrante do sangue-cérebro-barreira altamente especializado (BBB). BMECs estão interligados por proteínas juncionais ligados a uma membrana basal. Juntamente com os pericitos, células musculares lisas, pés terminais astrocíticos e células sanguíneas circulantes formarem o chamado unidade neurovascular (NVU) 1. Contra o conceito anterior de uma barreira impermeável entre o sangue e o sistema nervoso-central (SNC), o NVU é uma interface dinâmica, altamente específica e regulado, que controla a passagem de fluidos, moléculas e células entre vasos sanguíneos cerebrais e do sistema nervoso central 2 . Uma disfunção ou desregulação do NVU podem iniciar e / ou contribuir para uma variedade de neuro-vasculares, doenças infecciosas, inflamatórias ou degenerativas do sistema nervoso central, tais como acidente vascular cerebral isquémico, HIV-encefalopatia, esclerose múltipla, doença de Parkinson ou de Alzheimer 3-6. _content &quot;&gt; A monocamada BMEC é hermeticamente fechado por um complexo juncional constituído de apertado (TJ) e conexões aderentes (AJ) 7. A alta resistência elétrica ea baixa permeabilidade paracelular do BBB se baseiam principalmente nas proteínas TJ 8. Os TJs são complexos formados pelas proteínas transmembranares da família claudina e ocludina, que estão ligadas ao citoesqueleto das células endoteliais por moléculas adaptadoras, tais como os zonulaoccludens (ZO) proteínas ZO1-3 4. junções aderentes são montados, principalmente, pela proteína de membrana integral -cadherin vascular endotelial (VE), que está ligada ao citoesqueleto através cateninas 8. O fechamento hermético da certificação impede a livre troca de substratos e células entre o sangue e líquor. Exceções a essa regra são lipofílicos moléculas pequenas, com um peso molecular &lt;400 Da, que são capazes de atravessar a certificação por mediada por lipídios difusão 9. A passagem do maior e / oumoléculas hidrófilas, tais como a glucose, aminoácidos, péptidos, proteínas e diversos fármacos é limitada a sistemas altamente controladas de transporte transcelular 10, que podem ser classificadas em cinco categorias principais: transporte mediado por transportador, de transporte de iões, o transporte de efluxo activo, mediado por receptores transporte, e mediada por caveolae transporte 4. Estes sistemas de transportadores de ajudar a manter a homeostasia do sistema nervoso central, o que é necessário para a geração de um sinal preciso, transdução e integração. Além disso, BMECs são capazes de controlar activamente a transição de moléculas distintas pela expressão de uma variedade de ectoenzimas. Estas enzimas estão localizadas na superfície da célula e modificar os substratos endógenos e exógenos específicos impedindo ou permitindo a passagem do BBB 11. Considerando que o CNS foi considerada como um órgão imunológico privilegiado por um longo tempo, descobertas recentes sugerem um sistema muito dinâmico e fortemente regulamentado de surv imunológicoeillance do SNC. Os BMECs estão criticamente envolvidas na regulação da transmigração de células imunes. Pela expressão de selectinas sobre as suas superfícies linfócitos são induzidos selectivamente para ligar frouxamente ao endotélio. A secreção de quimiocinas que se deparam com receptores específicos na leucócitos leva à expressão ou alterações conformacionais de integrinas de leucócitos, tais como LFA-1 (antigénio de funções de linfócitos associada-1) e VLA-4 (antigénio muito tardio-4). As integrinas mediar uma adesão firme ao ligar seus counterreceptors endoteliais, por exemplo, VCAM-I (molécula de adesão celular vascular), ICAM-I (molécula de adesão intercelular) que permite a transmigração para o parênquima cerebral entre ou através BMECs do BBB 12-14. Estas e outras conclusões sublinham o papel ativo do próprio endotélio na regulação da migração de células imunes. Além disso, BMECs como parte do NVU estão envolvidos na regulação do fluxo sanguíneo cerebral linked às demandas metabólicas neuronais locais. Após estimulação astrocitário células endoteliais produzem substâncias vasoactivas, tais como o óxido nítrico, conduzindo ao relaxamento das células musculares lisas vasculares 15. Angiogênese e neurogênese no desenvolvimento, bem como na padronização paralelo adulto show de cérebro e desenvolvimento e compartilham muitas propriedades de regulação 1, 4. As células endoteliais estão criticamente envolvidas nestes processos 16, 17. Em resumo, BMECs fornecer recursos essenciais para justificar um bom desenvolvimento e funcionamento do SNC. BBB disfunção está ligada a muitas doenças neurológicas graves. No entanto, só muito poucos alvos foram identificados na interface cérebro-vascular para um tratamento específico e eficiente 18. Simplificado modelos in vitro têm sido usados ​​para compreender os mecanismos envolvidos na função e regulação de sistemas fisiológicos complexos para a lotempo ng. O isolamento como descrito por este manuscrito e estudo in vitro de murino BMECs, dada a grande variedade de rato específico nocaute estirpes, pode proporcionar uma maior compreensão da função e regulação BBB em condições fisiológicas e fisiopatológicas que se abrem novos caminhos terapêuticos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bFGF</td>
			<td style="width:133px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-18B</td>
			<td style="width:331px;">Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BSA</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9418</td>
			<td>Bovine serum albumine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Collagenase CLS2</td>
			<td style="width:133px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004176</td>
			<td>High relative level of protease activity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagenase-dispase</td>
			<td style="width:133px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:123px;">10269638001</td>
			<td style="width:331px;">Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagen IV</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0543</td>
			<td style="width:331px;">From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5030</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DNAse</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F6178</td>
			<td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Heparin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3393</td>
			<td>Anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PDS</td>
			<td style="width:133px;">First Link UK Ltd.</td>
			<td style="width:123px;">60-00-850</td>
			<td>Plasma-derived serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Percoll</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1644</td>
			<td>Warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pyrumycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td>Should only be used in first 2 d of culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Imediatamente após o isolamento, BMECs murino e células contaminantes formar conglomerados que flutuam no meio de cultura celular (Figura 1A, dia 0). O tratamento com pyrumycin leva a uma selecção de BMECs de murino uma vez que expressam elevados níveis de transportadores de efluxo tais como P-glicoproteína que conduz a uma resistência em relação a toxinas. Células contaminantes são muito mais suscetíveis a pyrumycin mediada citotoxicidade 19. Durante o processo de selecção pyrumicin, células contaminantes entrar morte celular apoptótica ou necrótica, enquanto MBMECs começar a prender às colagénio IV / revestidas com fibronectina placas de cultura celular (Figura 1A, dia 1 e dia 2). Até dia 5, os MBMECs proliferam a uma densidade de aprox. 80 - 90%. Eles são caracterizados pela aparência típica em forma de fuso. Na confluência, elas formam uma monocamada de células de contacto inibido não sobrepostos embaladas apertadamente, alinhados longitudinalmente e (Figura 1A, o dia 5). Porpyrumicin selecção, um elevado grau de pureza de até 99% é atingido MBMEC como demonstrado pelo marcador celular endotelial CD31 (PECAM1; Figura 1B). Os MBMECs formar monocamadas estreitamente selados interligados por proteínas de junções apertadas. Após 7-8 dias de cultura, as camadas de células endoteliais construir-se estáveis ​​para valores de resistência eléctrica (atingindo os valores típicos entre 20 - 30 Ω cm x 2). E capacitância (Figura 1C) Neste ponto de tempo de ensaios funcionais, tais como célula.dia experiências de migração 3, 20,21 e permeabilidade testes, por exemplo, com Evans azul ou dextrano, deve ser realizada. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. morfológica e propriedades funcionais de Murino BMECs. (A) Claro tempo Representante da BMECs cultivadas vistos por transmissão de luz microSCOPY mais de 5 dias. Barra de escala aplica-se para todas as imagens. (B) coloração de imunofluorescência para o marcador celular endotelial CD31 no dia 5. CD31 (verde) e DAPI (azul). (C) As células foram pré-cultivados durante 5 dias e depois transferidas para um sistema automatizado para a análise das propriedades biofísicas (resistência e capacitância). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.0K visualizações.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Vídeo: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

Geração de uma Murine Cérebro Imortalizado linha celular endotelial microvascular como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sangue Cérebro Modelo Barreira

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Neurociência

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Identificando marcadores de superfície celular da haste neural primária e células progenitoras por rotulagem metabólica de Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

Derivação, Expansão, Criopreservação e Caracterização de Células Endoteliais Microvasculares Cerebrais de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.