Mitocôndrias fornecem energia celular através da fosforilação oxidativa contribuindo para quase todos os processos dentro da célula. Consequentemente, as disfunções mitocondriais estão associadas a um amplo espectro de doenças. A principal vantagem dessa técnica é a medição em tempo real dos bioenergésicos mitocondriais pelo consumo de oxigênio e, portanto, uma avaliação precisa do metabolismo total da energia celular.
A respirometria de alta resolução permite uma avaliação direta do que no sistema de fosforilação oxidativa está falhando, potencialmente fornecendo pistas diagnósticas em doenças mitocondriais primárias e disfunções mitocondriais secundárias associadas a muitos distúrbios. Demonstrando o procedimento será Ryan Awadhpersad, doutorando no meu laboratório. Para começar, realize a calibração de oxigênio executando os respirômetros em 2,1 mililitros de meio de respiração mitocondrial a 37 graus Celsius por mais de 45 minutos e proceda se a variação da linha de base estiver dentro de quatro picomoles por segundo.
Cultura HEK293 células em DMEM de alta glicose suplementadas com FBS ativados pelo calor de 10%, GlutaMAX, aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio e uridina em uma incubadora a 37 graus Celsius a 5% de dióxido de carbono. No dia do experimento, colete e conte as células e resuspende 2,5 milhões de células em 2,5 mililitros de respiração. Para avaliar a respiração de rotina, adicione 2,3 mililitros de suspensão de células médias de respiração quente à câmara.
Corra as câmaras a 37 graus Celsius e uma velocidade de agitação de 700 RPM. Aguarde pelo menos três minutos para permitir que a mídia desconste, em seguida, feche as câmaras torcendo a rolha em um movimento rotativo. Em seguida, aspire o excesso de líquido em cima da rolha.
Após 10 minutos, obtenha um sinal estável de fluxo de oxigênio para registrar a rotina ou afirmar que eu respiração. Para realizar a análise oxphos em células intactas, adicione dois microliters de oligomicina de 0,01 mililitro para uma concentração final de 10-nanomolar. Titrate FCCP de estoque de dois mililitros adicionando 0,6 microliters a 0,2-microliter passos até que nenhum aumento na respiração seja observado e a respiração seja maximamente desacoplada.
Em seguida, adicione um microliter de rotenona de um mililitro para uma concentração final de 0,5-micromolar. Em seguida, adicione dois microliters de um miligrama por estoque de antimicina mililitro para uma concentração final de um micrograma por mililitro. Reoxigenar a câmara ao mesmo nível de oxigênio, aproximadamente 150-micromolar, levantando o êmbolo.
Depois, adicione cinco microliters de 0,8-molar ascorbate para uma concentração final de dois mililitros. Em seguida, adicione imediatamente cinco microliters de 0,2-molar TMPD para uma concentração final de 0,5 mililitro e avalie a atividade iv complexa. À medida que o pico de fluxo de oxigênio é atingido com TMPD, adicione cinco microliters ou quatro molares azida para uma concentração final de 10 mililitros.
Em seguida, continue a execução por pelo menos cinco minutos para avaliar a auto-oxidação do TMPD para o cálculo complexo do nível base IV. Após a execução, colete um mililitro de suspensão amostral de cada câmara e centrífuga a 1.000 G para células permeabilizadas ou a 20.000 G para lise tecidual. Em seguida, descarte o supernasciente e congele a pelota a menos 80 graus Celsius para uma análise mais a jusante.
Primeiro, semear as células de acordo com as taxas de crescimento das linhas celulares individuais. Diluir a oligomicina, FCCP, rotenona e antimicina em três microliters de médio ensaio para uma concentração final de 1,5-micromolar, 1.125-micromolar e um micromolar, respectivamente. Posteriormente, preencha-os em portas separadas.
Observe as portas de injeção para garantir um carregamento uniforme das amostras. Ligue o sistema baseado em microplacos e computador e equilibre-os a 37 graus Celsius por pelo menos três horas. No dia do ensaio baseado em microplacos, verifique a confluência da placa de cultura celular, a morfologia das células e certifique-se de que os poços de fundo estão vazios.
Em seguida, remova tudo, exceto 20 microliters do meio cultural de cada poço. Em seguida, lave cada poço com 90 microliters de médio ensaio e adicione 100 microliters de meio de ensaio para fazer um volume final de até 120 microliters. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora sem dióxido de carbono por 60 minutos.
Depois de recuperar a placa da incubadora, remova a tampa e coloque a microplaca na ranhura. Clique em Continuar para iniciar a execução. Depois que a corrida estiver concluída, retire a placa e remova a mídia restante do ensaio sem perturbar as células.
Em seguida, congele a placa inteira a menos 80 graus Celsius. Após a realização dos experimentos de permeabilização e respiração de digitonina, foram registrados traços de consumo de oxigênio bruto de células HEK293 do tipo selvagem e células HEK293 com um nocaute genético mediado pelo CRISPR, resultando em múltiplas deficiências de OXPHOS. Foram obtidos traços de consumo de oxigênio normalizados por entrada de células sobrepostas.
Crispr knockout 1 mostra respiração prejudicada e crispr nocaute 2 não mostra respiração em comparação com tipo selvagem quando normalizado para número de célula. As quantidades proteicas foram quantificadas e os valores respiratórios foram normalizados em quantidade proteica, a fim de determinar valores absolutos dos estados respiratórios e respectivas razões de controle de fluxo. As taxas de acidificação extracelular foram encontradas para aumentar a deficiência de OXPHOS no nocaute CRISPR 2, sugerindo compensação da deficiência de fosforilação oxidativa mitocondrial nas células HEK293 através do aumento da glicólise.
Além disso, os valores respiratórios foram determinados na presença de oligomicina, FCCP e rotenona, e os valores obtidos foram normalizados para a quantidade proteica. Foram estudados traços de consumo de oxigênio normalizados de células HEK293 do tipo selvagem e células HEK293 com deficiência de tradução mitocondrial mediada pelo CRISPR, causando múltiplas deficiências de OXPHOS. Foram obtidos traços de consumo de oxigênio normalizados pelo tecido molhado do cérebro do rato e do músculo soleus do rato.
Os músculos soleus apresentam três vezes mais capacidade de OXPHOS e respiração do que o cerebelo. Com a respirometria baseada em câmara, é importante trabalhar rápido, pois a função mitocondrial diminuirá no momento em que você coletar suas amostras, e com a respirometria baseada em placas, é crucial adquirir uma densidade de semeadura ideal para minimizar a variabilidade. Para análise mais aprofundada, quantificação de proteínas ou imuno-blotting é possível.
Isso poderia determinar se uma alteração na função respiratória mitocondrial foi devido à abundância de complexos OXPHOS ou quantidade mitocondrial. Já há um século, foram encontradas células cancerígenas para realizar glicólise anaeróbica, além de OXPHOS mitocondrial. Isso sublinha a necessidade de avaliar bioenergetics mitocondriais.
Aqui demonstramos dois respirômetros considerados o padrão-ouro de hoje.
