Este protocolo demonstra a cristalização de proteínas em um dispositivo semelhante a um chip na coleta de dados de difração de raios X. Este dispositivo é chamado de cristal sobre cristal porque os cristais de proteína crescem em um único cristal de quartzo. Após o crescimento bem-sucedido de cristais de proteína em tais dispositivos, milhares de imagens de difração são coletadas de cada dispositivo à temperatura ambiente sem sequer tocar nos cristais de proteína.
A difração de raios X à temperatura ambiente é muito essencial para o estudo da função proteica envolvendo muitos estados conformacionais. Essas alterações proteicas informativas ou ações proteicas podem ser congeladas, portanto, não detectáveis na criocristalografia. Esses dispositivos podem ser usados para estudar processos de sinalização induzidos pela luz e mudanças redox.
Apenas um punhado de dispositivos fornece conjuntos de dados completos e redundantes. Para iniciar a pré-montagem do dispositivo, rotule o anel externo para a identificação da amostra. Inclua o nome do projeto, o número do dispositivo, a condição de cristalização e a data conforme desejado.
Em seguida, coloque o anel rotulado de cabeça para baixo em uma superfície limpa e coloque uma bolacha de quartzo dentro do anel externo. Em seguida, despeje uma pequena quantidade de óleo de imersão do microscópio em uma placa de Petri e mergulhe um calço no óleo, garantindo que ambos os lados do calço estejam bem revestidos. Remova qualquer excesso de óleo esfregando o calço em uma superfície limpa.
Em seguida, coloque o calço oleado em cima da primeira bolacha de quartzo. Misture a solução proteica e o tampão de cristalização na primeira bolacha de quartzo utilizando uma pipeta. Tente evitar bolhas de ar ao misturar.
O volume total da solução de cristalização não deve exceder a capacidade máxima da câmara de cristalização determinada pelo tamanho e espessura do calço. Colocar a segunda bolacha de quartzo sobre a solução mista. A solução se espalhará espontaneamente.
Em seguida, toque levemente na segunda bolacha de quartzo na borda para ajudar a espalhar o óleo enquanto empurra o ar para fora. Prenda o dispositivo parafusando um anel de retenção no anel externo. Se necessário, use uma ferramenta de aperto.
Evite o aperto excessivo, pois pode causar bolachas de quartzo delicadas para se deformar ou rachar. Armazene os dispositivos montados em uma caixa à temperatura ambiente ou dentro de uma incubadora com temperatura controlada. Depois de algumas horas ou dias, coloque o dispositivo de cristalização sob um microscópio e monitore o crescimento do cristal.
Se necessário, otimize as condições de cristalização conforme descrito no manuscrito. Para calibração, instale um cristal YAG fino no suporte do chip e, em seguida, instale a parada do feixe. Em seguida, abra o software Insitux e execute o programa indicado para obter imagens de fluorescência de raios X do feixe direto onde o dispositivo é um nome selecionado pelo usuário para o dispositivo de cristalização e dispositivo.
param é o nome do arquivo que contém parâmetros de controle específicos do dispositivo. Em seguida, encontre a posição precisa do feixe de raios X direto executando o programa de ajuste do perfil do feixe, onde a imagem de gravação é o nome do arquivo da imagem de fluorescência de raios X. Para a digitalização óptica, coloque um dispositivo de cristalização no suporte do chip e prenda usando um parafuso de aperto.
Em seguida, monte o suporte do chip no estágio de tradução do difratômetro através de um mecanismo cinemático. Dependendo da sensibilidade à luz da amostra de proteína e do objetivo do experimento, instale uma fonte de luz branca ou infravermelha para tirar micrografias da janela óptica do dispositivo. Quando a configuração estiver pronta, execute o programa de varredura inserindo o comando indicado para a varredura em movimento na linha de luz.
Em seguida, execute o programa de mosaico em um computador do usuário onde x é o valor inicial para a coluna e y é o valor inicial para deslocamentos desonestos de micrografias. O programa costura todas as micrografias em uma montagem de um a três micrômetros de resolução de pixels. Depois de costurar as micrografias, digite o comando indicado para executar o programa de busca de cristais.
Este programa realiza o reconhecimento de cristais e o planejamento de disparos e os principais parâmetros deste programa permitem a seleção específica de cristais e o planejamento de alvos. Remova a fonte de luz e posicione a parada do feixe. Em seguida, execute o programa de coleta de dados para difração serial.
O comando sugerido aciona a coleta de dados visitando as fotos planejadas em uma sequência pré-programada. Cada cristal alvo é translocado para a posição do feixe. Em cada parada, a exposição a raios-X é feita com ou sem uma iluminação a laser em um atraso de tempo programado.
No estudo, as condições de cristalização entre a difusão de vapor e um lote on-chip foram comparadas. Quatro estudos de caso de cristalização on-chip e conjuntos de dados representativos coletados diretamente de dispositivos de quartzo são demonstrados aqui. Os experimentos de cristalografia dinâmica revelaram mudanças induzidas pela luz na proteína fotorreceptora vermelha distante, comparando dados de 4.352 cristais no escuro e 8.287 cristais após a iluminação da luz.
O conjunto de dados escuros da difração de Laue serial in situ resultou em densidades eletrônicas melhor resolvidas, permitindo a construção de um modelo confiante de um cromóforo bilino em uma conformação de sinal Z toda. Os mapas de diferenças induzidas pela luz revelaram movimentos concertados na folha beta central, sugerindo a importância do empilhamento pi-pi entre os anéis de pirrol do cromóforo e vários resíduos aromáticos. Essa plataforma é chamada de Insitux.
A vantagem única desta plataforma é que não é necessário fazer nenhuma manipulação de cristal uma vez que a cristalização é feita. É necessário coletar muitos conjuntos de dados sob condições variáveis para capturar os movimentos das proteínas. E isso se torna possível com o Insitux porque ele permite a coleta de dados em larga escala de milhares de cristais de proteína à temperatura ambiente.
Com essa nova capacidade, incluindo a cristalografia, os sistemas sensíveis à luz podem ser acionados dentro do dispositivo e o sistema inerte à luz pode ser estudado se o dispositivo cristal sobre cristal for convertido em saídas.
