O uso de diferentes substratos de energia é tanto tipo celular específico quanto indicativo de doença. Medir o consumo dos substratos específicos pode lançar luz sobre a biologia normal e a patologia. A técnica não precisa de equipamentos especializados e é fácil de escalar.
Também é mais fácil de usar do que os métodos publicados anteriormente. A compreensão das mudanças na taxa de oxidação do substrato permitirá o desenvolvimento de intervenções dietéticas e farmacológicas para distúrbios metabólicos. Embora demonstrada com tecido ósseo esta técnica é facilmente personalizada para estudar a flexibilidade metabólica em todos os tipos de células, proporcionando uma compreensão das causas e consequências das mudanças metabólicas.
Depois de sacrificar os filhotes de três a cinco dias pós-natal, transfira-os para o frio d pbs frio contendo penicilina streptomicina dupla solução antibiótico. Exponha a calvária removendo a pele e o tecido mole. Colete a região média cortando os tecidos circundantes de trás para frente em D PBS.
Coce as superfícies internas e externas da calvária suavemente usando pinças para ajudar a liberar as células após a digestão subsequente. Prepare 2 e 4 miligramas por mililitro de soluções de colagenase tipo dois em D PBS e filtre cada solução com um filtro fresco de 0,22 micrômetros. Primeiro, digerir a calvaria limpa com dois miligramas por solução de colagem mililitro por 15 minutos e, em seguida, descartar a solução de digestão.
Em seguida, digerir as amostras limpas em quatro miligramas por solução de colagenase mililitro três vezes por 15 minutos cada vez. Em seguida, puxe a solução de digestão e salve-a. Filtre a solução de digestão através de cepas de células de 70 micrômetros e centrífugue o filtrado a 300 RCF por cinco minutos.
Suspender a pelota celular em meio alfa MEM completo contendo 10% FBS e penicilina streptomicina dupla solução antibiótico. Conte e semee as células em uma placa de 10 centímetros. Cultume as células em uma incubadora Celsius de 37 graus com 5% de dióxido de carbono por três dias.
Em seguida, dissociar as células a 37 graus Celsius com 0,25 Trypsin EDTA. Após a digestão, conte e semente as células em uma placa de cultura de 24 poços com um meio alfa MEM completo contendo 10% FBS e penicilina streptomicina dupla solução antibiótico. Semente pelo menos quatro poços por tipo de célula por substrato, e pelo menos três poços extras para cada tipo de célula para contagem pré-ensaio.
Cultume as células a 37 graus Celsius durante a noite. Depois de remover o músculo e o tecido conjuntivo de camundongos de oito semanas de idade e coletar fêmures e tíbias, corte e descarte ambas as extremidades dos ossos com uma tesoura afiada. Limpe a medula óssea de um fêmur e uma tíbia em uma placa de Petri fresca de 10 centímetros com uma seringa equipada com uma agulha de calibre 23 contendo 15 mililitros de meio alfa MEM completo com 10% FBS penicilina dupla solução antibiótico, e 10% CGM 14 12 meio condicionado.
Cultume as células da placa de Petri em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após três dias, descarte os meios de cultura e enxágue as células com D PBS. Dissociar as células anexadas a 37 graus Celsius com 0,25% Trypsin EDTA por cinco minutos.
Após a centrifugação, suspenda a pelota celular no meio BMM. Conte e semee as células em uma placa de cultura de 24 poços de células pelo procedimento descrito anteriormente. Cultura a 37 graus Celsius durante a noite no meio BMM antes de iniciar os ensaios.
Lave as células nos poços extras duas vezes com D PBS. Dissociar as células com 0,25% Trypsin EDTA. Suspender 20 microliters de células digeridas em D PBS.
Com 20 microliters de laranja acridina e solução de corante de ióide de propídio, determine o número de células vivas com um contador celular automatizado e registe o número. Lave as células nos poços de ensaio duas vezes com D PBS. Adicione 500 microliters de meio quente a cada ensaio bem na capa de cultura de tecido designada RAM.
Depois de selar a placa com parafilme, incubar as células em uma incubadora designada RAM a 37 graus Celsius por 4 horas. Durante a incubação, corte o papel filtro em pedaços circulares, ligeiramente maior que a área dentro da tampa do tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro e insira o papel na tampa. Adicione 200 microlitres de um molar ácido perpólorico a cada tubo e 20 microlitres de hidróxido de sódio ao papel filtro instalado dentro da tampa.
Após a incubação das células, transfira 400 microliters de meio de cultura de cada poço para os tubos preparados e feche as tampas imediatamente. Deixe os tubos em um rack de tubo em temperatura ambiente por uma hora. Paralelamente durante a incubação configure um frasco de cintilação para cada tubo e preencha-o com quatro mililitros de fluido de cintilação.
Transfira cada pedaço de papel filtro para um frasco de cintilação e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Realize testes de limpeza na capa da cultura tecidual, no banho de água, geladeira, incubadora, pia, no chão e em qualquer outra área de trabalho para possível contaminação por RAM. Coloque os lenços de papel em frascos de cintilação contendo fluido de cintilação.
Meça a atividade de rádio carbono 14 nos frascos de cintilação com um contador de cintilação e regissuça os resultados da leitura. Descontaminar o ambiente de trabalho, de acordo com as diretrizes de segurança da radiação, se necessário. A figura compara a oxidação do substrato por pré-osteoblastos de calvaria primária versus BMMs.
Depois que as células primárias são permeadas e cultivadas em meio alfa MEM completo durante a noite, elas normalmente atingem 80 a 90% de confluência e exibem sua morfologia característica. Os pré-osteoblastos calvariais são notavelmente maiores que os MMMs. Os resultados da oxidação do substrato mostraram que a taxa de oxidação para cada substrato é significativamente maior em pré-osteoblastos calvariais do que os MMM, provavelmente indicando maior produção de energia por fosforilação oxidativa nos pré-osteoblastos.
O terceiro papel inserido deve ser ligeiramente maior do que uma tampa de tubo de ebin de 1,7 mililitro. Este método pode ser usado em conjunto com o consumo de oxigênio e para determinar a taxa global de fosforilação oxidativa e produção lactativa nas células. Este protocolo pode ser usado para determinar o uso de substratos durante estágios distintos de diferenciação ou configurações de doenças.
Com esse conhecimento podemos desenvolver intervenções para distúrbios metabólicos.
