Adh e FAD são moléculas endógenas que exibem autofluorescência em diferentes comprimentos de onda de excitação e emissão. Devido ao seu uso como co-enzimas de reações metabólicas, a microscopia de autofluorescência pode avaliar o metabolismo celular. A imagem de autofluorescência de NADH e FAD não requer rótulos exógenos e é um método não destrutivo com resolução subcelular.
A microscopia de autofluorescência pode ser usada em amostras vivas e para estudos de curso de tempo. Imagens autofluorescentes podem ser amplamente aplicadas a qualquer célula viva ou tecido. Imagens autofluorescentes têm sido usadas em neurônios, células cancerosas, tumor, in-vivo, células-tronco e células imunes.
Demonstrando o procedimento estará Linghao Hu, estudante de pós-graduação do Laboratório de Imagem Óptica Quantitativa da Universidade Texas A&M. Inicie o experimento ligando todos os componentes do microscópio de vida de fluorescência multifótons, incluindo a fonte de laser e os detectores. Antes da colocação da amostra, ligue a lâmpada de campo brilhante e certifique-se de que a luz entre na ocular.
Então, escolha um objetivo para a imagem celular. Se não usar um objetivo de ar, aplique uma gota do meio de imersão apropriado em cima do objetivo. Coloque o prato de fundo de vidro sobre o suporte de amostra no estágio do microscópio.
Em seguida, centralizar a amostra com o objetivo usando o controle de estágio X/Y Certifique-se de que a amostra está presa e não se moverá durante a imagem. Uma vez feito, olhe para a ocular e mova o objetivo para cima para se concentrar nas células. Se o microscópio estiver dentro de um gabinete, feche a porta da caixa de luz.
Em seguida, abra o software de aquisição de imagens e clique na guia Imagens multifótons para definir os parâmetros de imagem de vários fótons conforme descrito no manuscrito. Ajuste o ganho do detector para o valor ideal para a imagem de vida da fluorescência, ou FILM. Em seguida, altere o tempo de moradia do laser gasto em cada pixel do espécime para o valor desejado.
Para nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, ou NADPH, coloque o laser multifóton para 750 nanômetros. Em seguida, confirme que o controle de energia do laser é definido em zero para que as células não sejam danificadas ao abrir o obturador no laser. Defina um filtro de emissão entre 400 e 500 nanômetros.
Quando os parâmetros estiverem definidos, comece a fotografar de forma focalizada ou visualização ao vivo para otimizar as configurações da imagem. Aumente lentamente a potência do laser de três a oito miliwatts, garantindo que as células estejam em foco. Uma vez ajustado, regise a potência máxima utilizada.
Use a configuração de potência máxima registrada para a imagem em outros segmentos da placa de Petri. Colete uma imagem NADPH-FILM com um tempo de integração de imagem de 60 segundos e verifique se a imagem tem um número suficiente de fótons, como um pico de 100 fótons para um pixel de citoplasma dentro da curva de decaimento de vida fluorescência. Se o número de fótons for muito baixo, aumente a potência do laser ou a duração da aquisição de imagens.
Para o dinucleotídeo de adenina flavin, ou FAD, imagem, ajuste o laser multifótons para 890 nanômetros e espere que o laser bloqueie o novo comprimento de onda. Certifique-se de que o controle de energia do laser seja definido em zero inicialmente. Defina um filtro de emissão entre 500 e 600 nanômetros.
Para otimizar as configurações de imagem, comece a fotografar de forma focalizada ou ao vivo, aumentando a potência do laser para 5 a 10 miliwatts e registrando a potência máxima utilizada. Use a mesma configuração de energia para a imagem FAD de campos de exibição subsequentes. Colete a imagem FAD-FILM com um tempo de integração de imagem de 60 segundos e verifique se a imagem tem fótons suficientes dentro da curva de decadência de vida fluorescência.
Se o número de fótons for muito baixo, aumente a potência ou duração do laser da aquisição de imagens e repita a imagem para um adicional de quatro a cinco campos de exibição, ou FOVs, com cada imagem espaçada a dois FOVs de distância. Para fazer uma solução de cianeto de sódio de 80 milimil, dissolva 130,24 miligramas de cianeto de sódio em 25 mililitros de PBS. Do prato de cultura, aspire 100 microliters de cultura média para substituir por 100 microliters de solução de cianeto de sódio para obter uma concentração de quatro milimiliar de cianeto no prato.
Coloque as células em uma incubadora por cinco minutos para permitir que as células reajam com a solução de cianeto. Após a exposição ao cianeto, adquira imagens NADPH e FAD das células como descrito anteriormente. O estudo calculou os parâmetros de vida da fluorescência utilizando a função de resposta do instrumento medido, ou IRF, a partir da ureia.
Os parâmetros foram mediados entre os pixels do citoplasma de cada célula utilizada para segmentação. Células individuais foram identificadas e mascaradas para eliminar o ruído de fundo. Em seguida, o núcleo foi identificado e projetado na máscara celular.
Além disso, as células foram filtradas para remover as áreas mascaradas que não se encaixam no tamanho das células típicas. A imagem de fluorescência multifotal de NADPH e FAD permitiu a visualização da morfologia celular e metabolismo antes e depois do tratamento de cianeto. Observou-se que a vida útil do NADPH diminui com o tratamento de cianeto, enquanto a vida da FAD aumenta após o tratamento de cianeto.
O enredo da caixa representativa indicou que a razão óptica redox das células MCF7 diminuiu após o tratamento de cianeto. A exposição ao cianeto diminuiu a vida útil de NADPH ponderada por amplitude das células MCF7. As curtas e longas vidas diminuíram para o NADPH, mas aumentaram para o ALFA 1 da NADPH.
Para a FAD, a vida útil ponderada de amplitude das células MCF7 aumentou após a exposição ao cianeto. Tanto as curtas quanto longas vidas aumentaram para a FAD, mas diminuíram para fad alfa um. É importante ter energia laser suficiente indo para as amostras, mas lembre-se, muita energia pode causar danos às células.
Como a imagem de autofluorescência não é prejudicial às células, ensaios bioquímicos subsequentes podem ser usados nas mesmas amostras.
