A lesão por arma branca é um método de lesão mecânica que induz ablação celular inespecífica. Este método facilita a avaliação da proliferação e diferenciação do CGR após lesão cerebral. A lesão por arma branca mediada por agulha é um método simples e eficientemente implementado para induzir lesão cerebral.
Este método pode ser aplicado a muitas amostras experimentais usando um conjunto padrão de ferramentas. A capacidade regenerativa do peixe-zebra foi ilustrada usando o modelo de lesão por arma branca. Novos conhecimentos sobre o mecanismo molecular que regula a regeneração neuronal contribuem para a terapia regenerativa no sistema nervoso central.
Comece colocando um peixe-zebra adulto anestesiado ou medaka em uma bandeja de isopor. Fixe o peixe na vertical entre duas agulhas de calibre 30 inseridas verticalmente no isopor. Segure o corpo do peixe para evitar que a cabeça do peixe se mova e, em seguida, insira verticalmente uma agulha de calibre 30 através do crânio na região medial de uma das esferas do tecto óptico.
Em seguida, transfira os peixes feridos para um tanque de peixes com água fresca da instalação de peixes. Uma vez que os peixes tenham se recuperado totalmente da anestesia, mova o tanque para o sistema de reprodução. Coloque papel toalha na bandeja de isopor para colocar o peixe anestesiado.
Em seguida, mantenha o corpo do peixe no lugar inserindo verticalmente duas agulhas de calibre 30 em cada lado da nadadeira anal. Uma vez que o peixe é colocado, faça uma incisão ventral do ânus para o coração. Mantenha o coração visível inserindo duas agulhas de calibre 30 de cada lado.
Em seguida, use a ponta da pinça para remover a camada epitelial prateada. Insira a agulha de calibre 30 no ventrículo, mantendo o bisel para cima, e faça uma incisão no átrio usando a pinça. Em seguida, empurre PBS para o átrio pressionando a seringa para lavar o sangue do átrio.
Quando o sangue é drenado e as brânquias ficam brancas, interrompa a perfusão PBS. Mais tarde, remova as agulhas que fixam o corpo do peixe no lugar e fixe o peixe ventralmente para baixo. Depois de cortar a medula espinhal e remover o crânio do tecto óptico e telencéfalo, cortar os nervos ópticos e dissecar o cérebro.
Em seguida, transfira os cérebros para tubos de 1,5 mililitro com um mililitro de paraformaldeído a 4% em PBS, para fixar durante a noite a quatro graus Celsius. Depois de lavar os cérebros fixos três vezes em PBS por cinco minutos cada, transfira os cérebros em tubos de 1,5 mililitro com um mililitro de sacarose de 30% do peso em volume em PBS como um crioprotetor e incube-os durante a noite a quatro graus Celsius. Prepare o composto de incorporação combinando 30% de sacarose com 30 mililitros de temperatura de corte ideal, ou OCT, composto e armazene o composto a quatro graus Celsius.
Para resfriar o criomold uma vez, incube um bloco de alumínio durante a noite a 80 graus Celsius negativos e coloque o bloco pré-resfriado em uma caixa de isopor com tampa para evitar o aquecimento. Para cortes coronais, incorporar o cérebro dissecado em um criomoldo ajustando a orientação usando pinça sob o microscópio. Em seguida, coloque o criomold no bloco de alumínio pré-resfriado na caixa de isopor e deixe o composto OCT congelar e ficar branco.
À medida que o composto congela, aplique um pequeno círculo de composto OCT em um disco de amostra antes de montar o criobloco no disco da amostra. Ao colocar o disco da amostra no criostato, congele o composto de OCT. Em seguida, coloque o disco da amostra na cabeça da amostra no criostato.
Depois de definir a orientação do criobloco, corte o OCT para remover quaisquer regiões extras. Corte seções seriais de 14 micrômetros de espessura através de todo o tecto óptico usando um criostático e armazene as lâminas a menos 25 graus Celsius. A proliferação de células gliais radiais, ou RGC, no tecido cerebral do peixe-zebra foi avaliada.
A maioria dos CGRs estava proliferando com antígeno celular negativo no hemisfério contralateral não lesado. Dois dias após a lesão, a proliferação do RGC foi induzida no lado lesado do tecto medaka. Após a lesão cerebral, a linhagem celular e a diferenciação do RGC foram avaliadas com a marcação com bromodeoxiuridina, ou BrdU.
A análise representativa mostra neurônios recém-nascidos sete dias após a lesão no peixe-zebra e medaka lesionados. Uma das etapas críticas nas lesões por arma branca é a inserção manual da agulha. Uma lesão consistente é necessária para criar resultados reprodutíveis.
Corantes fluorescentes são eficazes como marcadores de feridas. A extensão da difusão do corante fluorescente indica a localização e a profundidade da lesão por arma branca. Esta técnica é potencialmente adaptada a outras espécies de peixes pequenos, e a adaptação ao medaka permite comparações da capacidade regenerativa.
