A masarimicina é um dos poucos inibidores de autolysinas bacterianas que interrompe o crescimento celular bacteriano. Pode ser usado para investigar as diferenças entre a inativação química e genética de autolysinas, e fornece uma abordagem ortogonal da genética para estudar a fisiologia bacteriana. A síntese de masarimicina pode parecer assustadora.
Siga de perto os passos mostrados. Na dúvida se um passo de reação funcionou, confirme por cromatografia de camada fina e pelas alterações nos valores de RF. Para começar, prepare uma solução 0.1-molar de ciclohexylamina, carboxaldeído cyclohexyl, ácido orto-iodobenzóico, e isocianida de ciclohexyl no metanol.
Adicione a barra de agitação magnética, em seguida, misture cinco mililitros de ciclohexilamina e cinco mililitros de carboxaldeído de ciclohexyl em um frasco de fundo redondo tampado e coloque o frasco em um banho de areia em um agitador de placa quente por 30 minutos a 40 graus Celsius. Monitore a temperatura usando um termômetro colocado aproximadamente um centímetro abaixo da superfície da areia. Após 30 minutos, adicione cinco mililitros de isocianto ciclohexil à solução e mexa por mais 20 minutos a 50 graus Celsius.
Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido orto-iodobenzóico à mistura de reação e continue mexendo a 55 graus Celsius por três a cinco horas. Após três horas de agitação, monitore o progresso da reação periodicamente por cromatografia de camada fina, ou TLC, em intervalos de aproximadamente uma hora. Considere a reação completa quando apenas uma mancha com um fator de retenção igual a 0,3 é visível na placa TLC.
Remova o solvente no evaporador rotativo sob pressão reduzida. Uma vez que todo o metanol é evaporado, dissolva o produto bruto seco em 30 mililitros de acetato de etila e transfira-o para um funil separador. Extrair acetato de etila sequencialmente com ácido clorídrico de um molar, água, solução de bicarbonato de sódio saturado, água novamente e solução de cloreto de sódio saturado, descartando as camadas aquosas em cada extração.
Em seguida, remova a camada de acetato etílico do funil separador e colete-a em um frasco de Erlenmeyer. Adicione uma espátula cheia de sulfato de sódio anidro para remover água residual do acetato etílico. Filtre a solução de acetato etílico seco através de um papel filtro número um para remover o sulfato de sódio.
Em seguida, lave o papel do filtro com uma pequena quantidade de acetato etílico. A solução filtrada de acetato etílico foi evaporada para ressecamento em um evaporador rotativo sob pressão reduzida para obter masarimicina como óleo uma vez que todo o acetato etílico é removido. Dissolva o óleo de masarimicina em um a dois mililitros de um hexano 9:1 para solução isopropanol e mexa em uma placa de agitação magnética até que todo o composto seja dissolvido.
Para purificar a masarimicina dissolvida, realize cromatografia flash com uma coluna flash de 12 gramas, de fase normal, sílica. Equilibre a coluna flash com volumes de 10 colunas de fase móvel com os instrumentos definidos a uma vazão de 15 mililitros por minuto. Após a conclusão do equilíbrio, desenhe a masarimicina dissolvida usando uma seringa de cinco mililitros.
Conecte a seringa diretamente à parte superior da coluna flash equilibrada e injete a solução na coluna. Reconecte a coluna carregada ao sistema de cromatografia flash e inicie a elução gradiente. Masarimicina eluto da coluna usando elução gradiente para uma concentração final de fase móvel de 10:90 hexano para isopropanol em mais de 12 volumes de coluna.
Monitore a eluição da masarimicina via absorção em 230 e 254 nanômetros. Para o estudo da morfologia, grow bacillus subtilis 11774 em placas de ágar LB a 37 graus Celsius. Em todos os experimentos subsequentes, use células de segunda passagem cultivadas em cinco mililitros de caldo LB até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja 1.
Em seguida, usando uma pipeta, adicione masarimicina aos tubos de cultura rotulados tratados com uma concentração final de 3,8 micromoles. Para tubos de cultura rotulados controle, adicione um volume equivalente de DMSO. Coloque as amostras em uma incubadora a 37 graus Celsius por 90 minutos com agitação a 150 RPM.
Após 90 minutos, conserte quimicamente as culturas em uma mistura de 1:10 de mídia cultural e fixação de buffer a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use uma pipeta para aplicar de 10 a 20 microlitros das amostras quimicamente fixadas em lâminas de microscópio de vidro e permitir que elas sequem. Em seguida, fixar as amostras secas de ar aquecendo as lâminas de vidro usando um queimador Bunsen.
Após a fixação do calor, colorigue as amostras com 100 microlitadores de azul de metileno de 0,1%. Após uma incubação de 10 minutos com a mancha, lave o excesso de corante com água destilada. Em seguida, aqueça suavemente os slides manchados a 60 graus Celsius em um forno por 15 a 20 minutos para levar as células a um plano focal comum.
Sele as amostras manchadas colocando uma tampa de microscópio sobre as células manchadas. Em seguida, sele as bordas usando cimento slide de microscópio. Coloque o slide do microscópio selado no estágio do microscópio e coloque a imagem em foco com a ampliação de 100X usando microscopia de campo brilhante.
Coloque uma gota de óleo de imersão no slide do microscópio e traga o campo de visão para se concentrar usando a ampliação de 1000X. Adquira micrografias usando uma câmera ligada ao microscópio e seu software associado. Adquira imagens usando as configurações de equilíbrio e abertura automática do software.
A cromatografia flash permite a purificação rápida da masarimicina com alta pureza. A avaliação da sinergia ou antagonismo com o inibidor atpase optochin em S.pneumoniae é apresentada aqui. A menor concentração do composto para inibir o crescimento bacteriano, indicada pela cor azul, é considerada o valor mínimo de concentração inibitória na presença de uma co-droga.
Em contraste, poços com cor rosa indicam crescimento bacteriano. Ensaios fenotípicos usando masarimicina a 0,75 vezes as concentrações inibitórias mínimas demonstraram um fenótipo semelhante a salsicha para B.subtilis e um fenótipo de s.pneumoniae. Preste atenção à temperatura da reação.
Certifique-se de que a reação esteja completa monitorando com tlc. Este método pode ser usado em conjunto com antibióticos fluorescentes rotulados para investigar alterações na parede celular por microscopia.
