Este método fornece novas informações sobre como produzir em massa conidia infecciosa de fungos entomopatômicos para controlar pragas de insetos importantes em agrossistemas comerciais, dada a situação atual em que a maioria dos inseticidas são eliminados gradualmente devido a preocupações de seu efeito tóxico sobre o meio ambiente e a saúde humana. A técnica descreve o método utilizado para garantir o rendimento ideal da conidia EPF durante a produção em massa. O método é útil para o manejo integrado de pragas e controle biológico, fornecendo uma visão sobre a eficácia da conidia produzida em massa para o manejo em larga escala de pragas prejudiciais de insetos resistentes a inseticidas nos agrosistematos.
Este procedimento foi desenvolvido e demonstrado pelo Dr. Letodi Luki Mathulwe, Dr. Nomakholwa Faith Stokwe e pela professora Antoinette Paula Malan. Aqueça um litro de água destilada e desligue o fogo antes de chegar ao ponto de ebulição. Agora, adicione 30 gramas de glicose, quatro gramas de fosfato de potássio dibásico, 20 gramas de extrato de levedura, 15 mililitros de licor de milho íngreme, e leve o conteúdo para ferver suavemente por dois a três minutos.
Despeje um total de 100 mililitros do meio em nove frascos diferentes de 250 mililitros. Coloque um plugue de algodão em cada frasco e cubra a lã de algodão com papel alumínio como rolha. Autoclave o meio nos frascos por 55 minutos a 121 graus Celsius.
Mais tarde, deixe o meio nos frascos esfriar e adicione 10 miligramas por mililitro de estreptomicina ao meio em cada frasco. Colete de duas a três alças bacterianas de conidia fúngica de placas de cultura fúngica de duas a três semanas de idade para ambos os isolados do EPF. Transfira a conidia fúngica para cada 100 mililitros de mídia líquida nos frascos de 250 mililitros em condições estéreis e selar os frascos.
Incubar os frascos de cultura líquida a aproximadamente 25 graus Celsius em um agitador orbital a 140 RPM por três dias e cessar a incubação uma vez que as culturas mostram sinais de alta turbidez com o crescimento de blastospore fúngico. Para detectar qualquer possível contaminação bacteriana das culturas, desenhe uma amostra de 100 microliters de cada frasco de cultura líquida após 24 horas de incubação e placa em três placas SDA por isolação. Incubar as placas por 48 horas a uma temperatura controlada de mais ou menos 25 graus Celsius.
Use um pequeno tubo de resíduo de cloreto de polivinil para criar um pescoço para o saco de fermentação na extremidade aberta do saco de autoclave e use fita autoclave para fixar o tubo. Feche o tubo com um plugue de algodão estéril para permitir a troca de gás suficiente durante a fermentação. Use arroz branco de grão longo parboiled como um meio de substrato sólido para os blastospores tanto de Metarhizium pinghaense quanto de Metarhizium robertsii.
Para cada saco de fermentação, adicione um quilo de arroz e 300 mililitros de água destilada estéril. Misture delicadamente o conteúdo dos sacos de fermentação. Coloque-os em sacos de autoclave externos em uma posição vertical e autoclave a 121 graus Celsius por 55 minutos.
Após a autoclavagem, deixe os substratos esfriarem por cerca de 45 minutos em condições estéreis. Remova o fechamento de cada um dos frascos de cultura líquida tanto do Metarhizium pinghaense quanto do Metarhizium robertsii sob um fluxo laminar e flame a borda de cada frasco por 10 segundos. Despeje 100 mililitros de culturas líquidas nos sacos de fermentação removendo os plugues de algodão de seus pescoços.
Coloque os plugues de algodão de volta e cubra a parte superior do pescoço do saco com papel cirúrgico preso com um elástico. Torça a parte superior da bolsa e misture o conteúdo da bolsa sacudindo e manipulando o substrato por massagem. Incubar as sacolas a cerca de 25 graus Celsius, achatando o substrato nos sacos para evitar a formação de leitos grossos.
Dois a três dias após a inoculação e incubação, quando ocorreu o crescimento micelial visível e a ligação do substrato pelo fungo, quebraram o substrato nos sacos de fermentação massageando o conteúdo das sacolas. Após a fermentação, transfira as culturas esporuladas em sacos de papel marrom de 26 a 30 kg e seque as culturas fúngicas por 10 a 12 dias antes de seu uso em ensaios. Para melhorar a resistência à tração dos sacos de papel, corte horizontalmente 1/3 da parte superior do saco e forra a parte inferior do saco.
Destrua suavemente o substrato em cada saco de fermentação. Corte o canto de cada saco e transfira lentamente toda a cultura para os sacos de papel através do espaço deixado pelo canto cortado. Rotule cada saco de papel, dobre sobre a extremidade superior de cada saco duas vezes e feche com grampos para criar uma estrutura de tenda triangular.
Coloque os sacos em racks de secagem de arame para permitir a secagem adequada, mesmo secando a uma temperatura controlada de cerca de 25 graus Celsius e baixa umidade de 30 a 40% Colher conidia fúngica das culturas usando três peneiras aninhadas montadas em uma panela de coleta. Carregue lentamente a amostra de cultura seca na malha ETS número 35 e peneira. Coloque uma tampa na peneira para evitar a liberação de conidia fúngica no ar.
Adicione 10 a 12 bolinhas de vidro nas peneiras para auxiliar a passagem da coníddia fúngica através das telas de malha e evitar a retenção da conidia na peneira, o que pode resultar em redução da recuperação dos esporos. Fita e veda as juntas de peneira usando fita elétrica. Coloque as peneiras em um agitador vibratório equipado com uma almofada pegajosa para fixar a panela de coleta e peneiras por 20 a 25 minutos a um movimento de 560 a 640 vibrações por minuto.
Remova as peneiras de teste da panela de coleta, colete conidia e armazene as conidia coletadas em sacos de zíper herméticos e impermeáveis para armazenamento a longo prazo. Uma média de aproximadamente 1,83 gramas de Metarhizium robertsii conidia seca foi colhida do substrato de cevada em flocos, enquanto zero Metarhizium pinghaense foi colhido do substrato. Nenhuma coníddia fúngica seca foi colhida do substrato de aveia em flocos para qualquer espécie de Metarhizium.
Observou-se diferença significativa entre as duas espécies de Metarhizium na conídio média estimada por grama colhida a partir dos grãos de arroz. Metarhizium robertsii tinha uma contagem média de conídios ligeiramente maior por grama do que Metarhizium pinghaense. Não foi observada diferença significativa entre as duas espécies de Metarhizium no número estimado de conídios presentes no substrato de arroz gasto.
No entanto, Metarhizium pinghaense tinha conidia ligeiramente maior no substrato de arroz do que Metarhizium robertsii Nenhuma diferença significativa é estimada nas duas espécies de Metarhizium em seu rendimento geral de conídio obtido a partir das culturas de substrato de arroz. No entanto, metarhizium pinghaense produziu um rendimento de conidia ligeiramente maior do que Metarhizium robertsii, que produziu um rendimento conidial menor. A parte desafiadora desta técnica é a contaminação do substrato através da inoculação com um inóculo de blastospores contaminados.
Assim, sempre garanta a esterilidade durante o trabalho. Essa demonstração ajuda os alunos a reproduzir eficientemente a técnica sem erros desajeitados que podem resultar no término de todo o processo.
